JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Published: May 14, 2018
doi:
10.3791/57383
, ,
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics,Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology,Boston University School of Medicine

Summary

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Abstract

Canlı hücre görüntüleme doğrudan tek hücreler biyolojik olayları uzun bir süre görselleştirmek için kullanılan güçlü bir tekniktir. Son on yıl içinde yeni ve yenilikçi teknolojileri oldukça canlı hücre görüntüleme pratiklik gelişmiş. Hücreler şimdi odakta tutulabilir ve sürekli olarak birkaç gün süre altında tutulan 37 °C ve %5 CO2 hücre kültür koşulları görüntüsü. Ayrıca, birden çok alan açısı farklı deneysel koşullar temsil eden aynı anda, böylece-mek şartıyla yüksek-den geçerek deneysel veri elde edilebilir. Canlı hücre görüntüleme doğrudan görselleştirme ve dinamik hücresel olaylar zamansal Nefelometri için vererek sabit hücreli görüntüleme önemli bir avantaj sağlar. Canlı hücre görüntüleme aksi takdirde nüfus tabanlı deneyleri kullanarak atlanmış tek hücre davranış değişimi de tanımlayabilir. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kurallarını açıklar. Biz yöntemleri mitotically olup olmadığını görmek için hücre ölmektedir doğrudan mitoz veya geri Interphase içine kayma tutuklandı göstermek. Ayrıca floresan ubiquitination tabanlı hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) sistem hücrelerinin hücre döngüsü yeniden girerek bir özelliği olan Mitotik kayma tarihi Interphase kesir değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Son olarak, biz nükleer zarf rüptürü olayları tanımlamak için bir canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Introduction

Anti-Mitotik uyuşturucu uzun solid tümör türleri kemoterapi rejimleri içinde kullanılmıştır ve büyük etkinlik1,2,3kez göster. Mechanistically, bu ilaçların normal Mitotik ilerleme bozabilir ve hızla Proliferasyona içinde Mitotik tutuklama teşvik kanser hücreleri. Ancak, hücre kader Mitotik tutuklama karşılık olarak son derece değişkendir: hücrelerin bir kısmı doğrudan doğruya–dan mitoz hücre ölümü geçer iken, diğerleri mitoz dışarı çıkıp tetraploid hücreler (bir süreç olarak adlandırdığı Mitotik kayma) olarak Interphase için dönmek4, 5,6,7,8. Bu Interphase hücreler apoptosis yürütmek, kalıcı hücre döngüsü tutuklama geçmesi veya bile hücre döngüsü4,5,6,7,8,9 yeniden girin ,10,11. Sadece uyuşturucu kaldırma, aşağıdaki hücre döngüsü yeniden girmek için Interphase kaymasını tarafından Mitotik hücre ölümü kaçmasına hücreleri bu nedenle kanser hücre nüfusun yeniden doğuş için katkıda bulunabilir. Ayrıca, mitoz slip tetraploid ve tetraploidy tümör sürücüler kromozom istikrarsızlık tanıtmak için bilinen hücreler12,13,14,15Relaps. Yanıt olarak anti-Mitotik ilaç tedavileri hücre kaderini kontrol faktörler tanımlama bu nedenle geçerli tedavi optimize etmek için önemlidir.

Bu protokol için doğrudan gözlemlemek ve anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel karşılık olarak uzun süreli Mitotik tutuklama tabi hücre kaderi çalışma yöntemleri açıklanmaktadır. Paklitaksel olduğunu kurulmuş bir klinikte tedavi ve göğüs, yumurtalık ve akciğerler16,17,18,19, de dahil olmak üzere birçok tümör türleri’nde, son derece etkili kanıtlamıştır 20. Paklitaksel, porsuk ağacı kabuğundan elde edilen bir bitki alkaloid olan mikrotübüller stabilize ve böylece onların dynamicity21,22engeller. Paklitaksel tarafından Mikrotubul dinamikleri nemlendirme G1 G2, hücre döngüsü ilerleme etkilemez iken ilaç Milli Meclis denetim noktası sürekli etkinleştirme sırasında mitoz engelleyen tarafından yol açmaz kinetochore-Mikrotubul eki (23,24burada derinlemesine gözden)25. Sonuç olarak, anafaz başlangıçlı Paklitaksel tedavi hücrelerinde ve uzun süreli Mitotik krizi sonuçlarında engellenir.

Bu iletişim kuralı önce canlı hücre görüntüleme deneylerde Mitotik hücre tanımlamak için yaklaşımlar anlatacağım. Mitoz iki fark hücre biyolojik değişiklikler nedeniyle yapisan doku kültürü hücrelerdeki görüntülenmeyecektir. İlk olarak, kromozomlar son derece hemen önce nükleer zarf arıza konsantre olmak. Kez tespit ederken çift faz kontrast mikroskobu tarafından kromozom yoğunlaşma floresan kullanarak Etiketler Bu etiket kromozomlar (örneğin fluorescently etiketli Histon proteinleri) daha iyi bir şekilde algılanabilir. İkinci, Mitotik hücre hücre yuvarlama neden dramatik morfolojik değişiklikler de belirlenebilir.

Bu iletişim kuralı sonra canlı hücre görüntüleme yaklaşımlar uzun süreli Mitotik tutuklama yaşandığı hücre kaderi izlemek için nasıl kullanılacağını gösterecektir. Hücreler mitoz içinde tutuklanan üç ayrı kader biri tabi. İlk olarak, hücre hücre ölümü sırasında mitoz uygulayabilir. Ölen hücreleri küçültme, bleb ve/veya yırtılması gözlemlediği gibi bu olay kolayca ışık mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. İkinci olarak, hücreler mitoz çıkabilirsiniz ve dönüş geri kromozom segregasyon veya sitokinez Interphase için bir işlemi Mitotik kayma olarak. Bu işlemi kromozom decondensation ve/veya kolayca Mitotik hücre düzleştirme tanımlar. Mitoz kayma hücreleri de sık sık düzensiz, çok loblu çekirdeği görüntülemek ve sık sık birkaç micronuclei5liman. Üçüncü olarak, hücreler mitoz içinde tutuklandı anafaz başlatmak ve mitoz uzun bir bekleme süresinden sonra devam edin. Nadir olsa da daha yüksek ilaç konsantrasyonlarda, bu davranış tutuklandı hücreleri Milli Meclis denetim noktası tatmin olması veya Milli Meclis denetim noktası kısmen zayıflamış veya arızalı olduğunu göstermektedir. Anafaz başlangıçlı kromozom segregasyon ve sonraki sitokinez canlı hücre Imaging’i kullanma tarafından görüntülenmeyecektir.

Mitotik kaymayı uygulanan tarafından Mitotik hücre ölümü kaçmasına hücreleri kaderi izlemek için canlı hücre görüntüleme yöntemleri de açıklanacaktır. Mitotik kayma geçmesi hücreleri ya sonraki Interphase ölecek, dayanıklı G1 hücre döngüsü krizi tetiklemek, ya da hücre bölünmesi4yeni bir tur başlatmak için hücre döngüsü yeniden girin. Mitotik kaymalarını aşağıdaki hücre döngüsü yeniden girin hücreleri kısmını belirlemek için FUCCI (floresan ubiquitination tabanlı hücre döngüsü göstergesi) sistemini kullanan bir yaklaşım açıklanacaktır. FUCCI G1/S geçiş doğrudan görselleştirme için sağlar ve uzun vadeli yaşamak- vitro ve in vivo26,27Imaging hücre ile birlikte kullanılabilir. FUCCI sistemi iki fluorescently etiketli protein, hCdt1 kesilmiş formları yararlanır (faktör 1 Kromatin lisans ve DNA ikileşmesi) ve hücre döngüsü konumuna bağlı olan düzeyleri salınım hGeminin. hCdt1 (kırmızı bir floresan protein erimiş) yüksek düzeylerde SCFSkp2 nerede bu DNA çoğaltma için lisans için davranır, ancak ubiquitinated E3 Ubikuitin ligaz tarafından G1 aşamasında mevcut olduğunu ve S/G2/M aşamaları sırasında önlemek için bozulmuş yeniden çoğaltma DNA26. Buna karşılık, hGeminin, (bir yeşil flüoresan protein erimiş) bir inhibitörü olan hCdt1 olan düzeyleri en yüksek S/G2sırasında /M, ama ubiquitinated E3 Ubikuitin ligaz APC tarafındanCdh1 ve mitoz sonunda G1 boyunca bozulmuş 26. hücreleri G1 ve yeşil Floresans S/G2/M sırasında sırasında kırmızı Floresans sergilemek gibi sonuç olarak, hücre döngüsü aşamasının bir basit Floresans okuma FUCCI sunar. FUCCI önemli bir ilerleme (bromodeoxyuridine boyama gibi) diğer yaklaşımlar çünkü o does değil istemek hücre fiksasyon ve tek hücre görüntüleme için gerek kalmadan ek sağlar proliferatif hücreleri tanımlamak için sistemidir farmakolojik hücre popülasyonlarının eşitlemek için tedaviler. Bu protokol için tartışılmamış rağmen ek canlı hücre sensörler de bir helikaz B sensör G128, DNA ligaz RFP29 ve PCDNA-GFP30 sensörleri için de dahil olmak üzere hücre döngüsü ilerleme görselleştirmek için geliştirilmiştir S-faz ve son FUCCI-4 sensör için hangi hücre döngüsü31tüm aşamalarında algılar.

Son olarak, nükleer zarf rüptürü algılamak için bir canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda nükleer zarf kanser hücrelerinin böylece nucleoplasm ve sitoplazma karışacak içeriğini izin veren kararsız ve patlama, eğilimli olduğunu ortaya çıkardı. Nükleer rüptürü, olarak adlandırdığı bu fenomen, DNA hasarı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı32,33,34,35,36,37, uyarılması tanıtabilirsiniz 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. nükleer kopma nedenleri eksik olarak karakterize kalırken, bu nükleer yapısında deformasyonlar bir nükleer rüptürü42olaylarının artması ile ilişkilendirmek bilinmektedir. Paklitaksel tedavisinin bir iyi bilinen etkisi çarpıcı anormal nükleer yapılar mitoz takip olduğunu; Bu nedenle, canlı hücre Imaging kullanarak nükleer rüptürü ölçmek için bir yöntem, Paklitaksel tedavi nükleer rüptürü olaylar sıklığı artarsa da keşfetmek açıklanacaktır. Nükleer rüptürü tarafından nükleer hedefli floresan protein kaçağı gözlenen (tandem dimer tekrar bir nükleer yerelleştirme sinyal TDRFP-NLS erimiş RFP,örneğin ) sitoplazma içine tespit edilebilir. Bu sızıntı rüptürü olayların basit Nefelometri sağlayan göz tarafından net olarak görünüyor.

Bu iletişim kuralı bir kodlanmış sahne ve autofocusing yazılım ile donatılmış bir widefield epifluorescence mikroskop gerektirir. Otofokus yazılım odak hücrelerde görüntüleme dönemi süresince korur sırada kodlanmış sahne alanı için tanımlanmış XY koordinatları, tam otomatik hareketi sağlar. Ayrıca, ekipman hücreleri ile 37 ° C’de % 5 CO2 nemlendirilmelidir korumak için bu protokolü gerektirir bir atmosfer. Bu bir sıcaklık içinde tüm mikroskop içine alarak elde edilebilir ve atmosfer kontrollü muhafaza veya sahne alıcı cihazlar kullanarak bu yerel olarak sıcaklık ve çevre korur. Bu protokol için kullanılan faz kontrast objektif bir planı fluor 10 olduğunu x 0,30 sayısal bir diyafram ile. Ancak, 20 X hedefleri de bir tek odak düzlemi içinde her iki yuvarlak Mitotik ve düzleştirilmiş Interphase hücrelerini tanımlamak için yeterli bulunmaktadır. Faz kontrast gerçekleştirme (Bu yöntemde anlatıldığı gibi) görüntüleme, kapak cam veya plastik olabilir. Fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullandıysanız, depolarizasyon ışık önlemek için bir cam kaplama kullanmak zorunludur.

Protocol

Bu iletişim kuralı olmayan dönüştürdü ve kromozom istikrarlı retina Pigmentli epitel (RPE-1) hücre kültürünü yaşamak-hücre görüntüleme deneyler için kullanarak odaklanmaktadır. Ancak, hücre kültür koşulları gerektiği gibi ayarlanır sürece bu iletişim kuralı için herhangi bir yapisan hücre kültürünü adapte edilebilir. Tüm yordamları kurumsal Biyogüvenlik ve Etik kurallar ve düzenlemeler için uygun olmalıdır. 1. hücreleri canlı hücre görüntüleme iç…

Representative Results

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, H2B GFP ifade RPE-1 hücreleri bir anti-Mitotik ya da araç denetimi ile (DMSO) değerlendirilmesi ve canlı hücre görüntüleme tarafından analiz. Analiz kontrol Mitotik RPE-1 hücreleri % 100’ünü anafaz 22 dk ortalama mitoz (şekil 1A, 1b) girdikten sonra başlatılan saptandı. Buna karşılık, Paklitaksel ile tedavi RPE-1 hücreleri süren birkaç saat (şek…

Discussion

En önemli bir özelliği, uzun vadeli yaşamak-hücre görüntüleme görüntüsü hücrelerin sağlığını garanti etmektedir. Bu hücreler sıcaklık, nem ve/veya CO2 düzeyleri ile ilgili standartların altında koşulları gibi çok az yabancı çevresel stres maruz esastır. Stres Imaging hücre davranış50etkilediği bilinmektedir olarak da floresan uyarma aydınlatma, üzerinden duyarlilik sınırlamak önemlidir. Duyarlilik sınırlama başka bir yerde48</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AFB, MAV ve NJG Ryan Quinton el yazması ve Adrian Salic TDRFP-NLS inşa etmek için yorum için teşekkür etmek istiyorum. AFB ve MAV NIGMS biyomoleküler Farmakoloji eğitim Grant 5T32GM008541 tarafından finanse edilmektedir. NJG Shamim ve Eşref Dahod meme kanseri araştırma laboratuvarları üyesidir ve NIH hibe GM117150 ve CA-154531, Karin Grunebaum Vakfı, Smith aile ödül programı, Searle akademisyenler Program ve Melanom araştırma tarafından desteklenmektedir İttifak.

Materials

phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?. Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug?. Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Tags

Live-cell ImagingCell FatePaclitaxelAnti-mitotic DrugMicroscopyKohler IlluminationAuto-focusTime-lapse ImagingCell Confluence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image