Долгосрочный клеток изображений для оценки судьбу клеток в ответ на паклитаксел
Summary
Клеток обеспечивает большой объем информации на отдельные ячейки или целые группы населения, которые недостижима, фиксированные ячейки изображений в одиночку. Здесь жить клеточной изображений протоколы для оценки решения судьбы клеток после лечения с анти митотическая наркотиков паклитаксел описаны.
Abstract
Клеток – это мощный метод, который может использоваться непосредственно визуализировать биологические явления в одиночных клетках более продолжительных периодов времени. За последнее десятилетие новые и новаторские технологии значительно расширили практичности клеток. Клетки теперь могут храниться в фокусе и непрерывно отображаемого в течение нескольких дней, пока поддерживается при 37 °C и 5% CO2 условий культуры клеток. Кроме того несколько полей зрения, представляющие различные экспериментальные условия могут быть приобретены одновременно, обеспечивая тем самым высок объём экспериментальных данных. Клеток обеспечивает значительное преимущество над-клеточной изображений, позволяя для прямой визуализации и височной количественный динамических сотовой событий. Клеток можно также определить различия в поведении одиночных камер, которые бы в противном случае были пропущены с использованием демографических анализов. Здесь мы описываем клеток изображений протоколы для оценки решения судьбы клеток после лечения с анти митотическая наркотиков паклитаксел. Мы демонстрируем, что методы, чтобы визуализировать ли mitotically арестован клетки умирают прямо из митоз или скольжения обратно в интерфазе. Мы также обсудим, как люминесцентные на основе ubiquitination клеточного цикла индикатор (FUCCI) система может использоваться для оценки доли межфазной клеток родился митотическая проскальзывания, которые способны повторного ввода клеточного цикла. Наконец мы описываем клеток изображений метод идентификации ядерная оболочка разрыв события.
Introduction
Анти митотическая препараты давно используется в химиотерапевтического лечения различных видов твердых опухолей и часто показывают большую эффективность1,2,3. Механически, эти препараты нарушить нормальный митотическая прогрессии и содействовать митотическая арест в быстро размножающихся клеток рака. Однако судьба клеток в ответ на арест митотическая сильно варьируется: в то время как часть клеток проходит смерти клетки непосредственно из митоза, другие выйти из митоза и вернуться к межфазное как тетраплоидные клетки (процесс называется митотическая проскальзывания)4, 5,6,,78. Эти клетки межфазной можно выполнять апоптоза, проходят постоянное клеточного цикла арест или даже повторно войти клеточного цикла4,5,6,,78,9 ,10,11. Клетки, которые уклониться от митотическая клеточной смерти, попадают в интерфазе, только для того, чтобы повторно войти клеточного цикла, после удаления наркотиков, поэтому могут способствовать появление рака клеточных популяций. Кроме того клетки, что скольжения от митоз тетраплоидные, и tetraploidy, как известно, содействовать нестабильности хромосомы, что диски опухоли рецидив12,13,14,15. Определение факторов, определяющих судьбу клеток в ответ на анти митотическая медикаментозного лечения поэтому является критически важным для оптимизации текущей терапии.
В этом протоколе мы описываем методы непосредственно наблюдать и изучать судьбу клеток, которые подвергаются длительной митотическая арест в ответ на паклитаксел анти митотическая наркотиков. Паклитаксел является установленным терапевтических в клинике и оказался весьма эффективным во многих типах опухолей, в том числе груди, яичников и легких16,,1718,19, 20. паклитаксел, который является завод алкалоид, полученный из коры Тисового дерева, стабилизирует микротрубочек и таким образом предотвращает их dynamicity21,22. Хотя увлажняющий микротрубочек динамики, паклитаксел не влияет на клеточный цикл прогрессии от1 G до G2, препарат привести к постоянной активации во время митоза шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускного пункта, препятствуя Кинетохор микротрубочек вложений (обзор в глубине здесь23,24)25. Как следствие начала анафазе предотвращается паклитаксел лечение клетки и приводит к продолжительной митотическая ареста.
Этот протокол будет сначала описаны подходы к идентификации митотическая клетки в клеток экспериментов и изображений. Митоз могут быть визуализированы в клетках адэрентных культуры ткани из-за двух биологические изменения заметны клеток. Во-первых хромосомы стать весьма конденсированных непосредственно перед ядерная оболочка пробоя. Хотя часто обнаруживаемых стандартных фазово контрастной микроскопии, конденсация хромосом могут быть более четко обнаруженные с помощью флуоресцентных Теги что лейбл хромосом (например дневно меченых гистоны). Во-вторых, митотическая клетки может быть идентифицирован драматических морфологические изменения, происходящие от клеток округления.
Этот протокол будет затем демонстрируется использование клеток изображений подходы для отслеживания судьбы клеток наблюдается длительное митотическая ареста. Арестован в митозе клетки проходят один из трех различных судьбы. Во-первых клетки могут пройти смерти клетки во время митоза. Это явление легко визуализируется на световой микроскопии, как умирающие клетки наблюдаются сжатия, пузырь, и/или разрыв. Во-вторых клетки могут выйти из митоза и вернуться обратно к межфазное без хромосома сегрегации или цитокинез, процесс называется митотическая проскальзывания. Decondensation хромосом и/или уплощение митотическая клеток легко идентифицирует этот процесс. Клетки, которые скольжения от митоз также часто отображения неправильная, дольчатая несколькими ядрами и часто гавани несколько микроядер5. В-третьих арестован в митозе клетки могут инициировать остановку анафазы и продолжите митоз после длительной задержки. Хотя редко при более высоких концентрациях наркотиков, это поведение предлагает что арестованных клетки могут удовлетворены шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт, или контрольно-пропускном пункте Ассамблея шпинделя частично ослабленные или дефектных. Анафазе начала могут быть визуализированы на хромосоме сегрегации и последующие цитокинез с использованием клеток.
Будут также описаны клеток изображений методы, чтобы отслеживать судьбу клеток, которые уклониться от митотическая клеточной смерти, претерпевает митотическая проскальзывания. Клетки, которые проходят митотическая проскальзывания умереть в последующих интерфазе, вызвать прочный арест клеточного цикла1 G или повторно ввести клеточного цикла, начать новый раунд клеточного деления4. Будет описан подход с использованием системы FUCCI (флуоресцентные на основе ubiquitination клеточного цикла индикатор) чтобы определить долю клеток, которые повторно войти клеточного цикла, после митотическая проскальзывания. FUCCI позволяет для прямого визуализации перехода/s1G и может использоваться в сочетании с долгосрочным клеток изображений как in vitro и in vivo26,27. Система FUCCI использует два дневно обозначенные белков, усеченной формы hCdt1 (лицензирование хроматина и репликацию ДНК фактор 1) и hGeminin, уровни которых колеблются на основе позиции клеточного цикла. hCdt1 (сливается с красного флуоресцирующего белка) присутствует на высоком уровне во время фазы1 G, где действует лицензировать ДНК для репликации, но убиквитинированных на E3 убиквитин лигаза SCFSkp2 и деградированных этапах S/G/m2для предотвращения Повторная репликация ДНК26. Напротив, hGeminin (сливается с Зеленый флуоресцирующий белок), является ингибитором hCdt1, вершина которого уровни во время S/G2/м, но это убиквитинированных на E3 убиквитин лигаза APCCdh1 и деградации в конце, митоз и всей G1 26. Следовательно, FUCCI обеспечивает простой флуоресценции индикация фазы клеточного цикла, как клетки экспонат красной флуоресценцией во время G1 и зеленая Флуоресценция во время S/G2/м. FUCCI система является значительным шагом вперед над другие подходы (например Бромдезоксиуридин окрашивание) для идентификации пролиферативной клетки, потому что он не требует фиксации клетки и позволяет для одной ячейки изображений без необходимости использования дополнительных фармакологической лечение для синхронизации клеточных популяций. Хотя не обсуждаются в настоящем Протоколе, дополнительные датчики клеток также были разработаны для визуализации прогрессии клеточного цикла, включая helicase B датчик G128, ДНК лигаза RFP29 и30 датчиков PCDNA-GFP S-фазе, и последние FUCCI-4-датчик, который обнаруживает всех стадиях клеточного цикла31.
Наконец будут описаны клеток изображений способ обнаружить разрыв ядерная оболочка. Недавние исследования показали, что конверты ядерных клеток рака нестабильной и склонной к разрывным, тем самым позволяя содержимое нуклеоплазмы и цитоплазме перемешивают. Это явление называется ядерного разрыва, могут способствовать повреждение ДНК и стимуляции врожденный иммунный ответ32,33,34,,3536,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. Хотя первопричины ядерной разрыв по-прежнему неполно характеризуется, как известно, что деформаций в ядерной структуре коррелирует с увеличением числа ядерных разрыв42. Один известный эффект лечения паклитаксел это поколение поразительно аномальные ядерных структур после митоз; Таким образом метод с использованием клеток изображений для количественного определения ядерного разрыва будут описаны, а также изучает, если паклитаксел лечения увеличивает частоту событий ядерного разрыва. Ядерного разрыва могут быть обнаружены наблюдаемых утечки ядерной таргетингом флуоресцентного белка в цитоплазме (например димер тандеме повторить из ППП, сливается с ядерной локализации сигнал, TDRFP-NLS). Эта утечка отчетливо видна на глаз, что позволяет простой количественный разрыв событий.
Этот протокол требует widefield эпифлуоресцентного микроскопа, который оснащен закодированные стадии и автофокусировки программного обеспечения. Закодированное этап позволяет точное автоматизированное движение для определенных координат X-Y, в то время как автофокусом программное обеспечение поддерживает клеток в центре внимания в течение периода обработки изображений. Кроме того, этот протокол требует оборудования для поддержания клеток при 37 ° C с увлажняется 5% CO2 атмосфера. Это может быть достигнуто, заключив весь Микроскоп в пределах температуры и атмосфера контролируемых корпус, или с помощью устройств этап топ, локально поддерживает температуру и окружающей среды. Цель фазово контрастной, используемые в настоящем Протоколе является план Флуор 10 x с числовой апертуры 0,30. Однако 20 X целей также являются достаточными для выявления как округлые митотическая и уплощенная межфазной клетки в одной фокальной плоскости. При фазово контрастной визуализации (как описано в этом методе), крышка может быть стекла или пластика. Если используется дифференциальной помехи микроскопия контраста (ОПК), крайне важно использовать стеклянную крышку для предотвращения деполяризации света.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным аспектом долгосрочной клеток изображений является обеспечение здоровья изображаемого ячейки. Важно, что клетки подвергаться минимальным посторонних экологических раздражители, такие нестандартные условия относительно температуры, влажности или CO2 уровней. Та?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, МАВ и NJG хотели бы поблагодарить Райан Quinton для комментариев на рукописи и Адриан Салическая для конструкции TDRFP-NLS. AFB и МАВ финансируются NIGMS биомолекулярных фармакологии обучения Грант 5T32GM008541. NJG является членом Шамин и Ашраф Даходе груди Рак научно-исследовательских лабораторий и поддерживается NIH грантов GM117150 и CA-154531, Карин Грюнебаум фонд, Смит семьи награды программа, программа ученых Searle и меланома исследований Альянс.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
References
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
- Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?. Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
- Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
- Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
- Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
- Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
- Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
- McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
- McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
- Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
- Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
- Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
- Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
- Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
- Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
- Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
- Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
- Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
- Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
- Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
- Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
- Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
- de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
- Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
- Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
- Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug?. Open Biol. 7 (11), (2017).
- Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
- Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
- Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
- Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
- Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
- Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
- Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
- Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).
