이 프로토콜에서 설명 하는 [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose 양전자 방출 단층 촬영 및 컴퓨터 단층 촬영 (18F FDG PET/CT) 이미징 타겟 치료 MLN0128는 에 종양 변화 응답을 측정 하기 위해 활용 하는 방법 Kra/Lkb1 돌연변이 마우스 폐암의 모델 및 결합 된 높은 해상도 ex vivo autoradiography와 양적 조직학 영상.
고급 종양의 특징은 쉽게 [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose 양전자 방출 단층 촬영 (18F FDG 애완 동물) 이미지에 의해 측정 된 호 기성 분해를 스위치입니다. KRA proto-oncogene LKB1 종양 억제기 유전자에 공동 돌연변이 hypermetabolic glycolytic 종양 성장 드라이브 폐암에서 자주 이벤트가 있습니다. 중요 한 통로 성장과 이러한 종양의 대사 조절 타겟팅 할 수 있습니다 효과적으로 선택적 촉매 mTOR kinase 억제제를 사용 하 여 rapamycin (mTOR) 통로의 기계적 대상입니다. MTOR 억제제 MLN0128 Kra와 Lkb1 공동 돌연변이, kl 기 쥐로와 종양 방위 쥐의 분해를 억제 합니다. KL 쥐에서 치료 응답 처음 18F FDG 애완 동물에 의해 측정 되 고 계산 된 단층 촬영 (CT) 이미징 하기 전에 MLN0128의 납품 후에. 18F FDG PET/CT를 활용 하 여, 연구원은 표적으로 한 치료와 치료 개입에 따라 폐암의 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)에 포도 당 물질 대사에 있는 동적인 변화를 측정 하 수 있습니다. 이 비보 전 autoradiography 및 형태학 소프트웨어를 사용 하 여 양적 immunohistochemical (qIHC) 분석 옵니다. QIHC 사용 하 여 탐지 및 정량화의 치료 뿐만 아니라 뚜렷한 종양 병 리의 특성에 따라 바이오 마커 프로필에 뚜렷한 변화를 수 있습니다. 양적 조직학을 애완 동물 화상 진 찰의 커플링 대사 및 치료 응답에 vivo에서 의 질병 마우스 모델에서 식별 하는 효과적인 전략 이다.
우리의 연구 조사 하 고 간 니 B1에에서 돌연변이와 암 (LKB1, STK11로 라고도 함)을 대상으로에 집중 했다 돌연변이 암1. LKB1 성장 및 물질 대사의 규제를 선도 하는 앰프 키 니 아 제 (AMPK)의 활성화를 통해 누르는 mTOR 복잡 한 1 (mTORC1) 마스터 종양 억제기 이다. 따라서, LKB1 손실 억제 mTORC1 활성화, 일반적으로 바르 부르 크 효과2,,34라고 glycolytic 대사 표현 형에 HIF1 알파 결과의 활성화에 지도 한다. LKB1 비활성화 돌연변이 직접적으로 Peutz Jeghers 증후군 (잠 옷) hamartomas5 로 알려진 양성 위장 폴립의 개발에 의해 특징은 알려진 드문 가족성 암 사전 처리 증후군의 발전으로 이어질 , 6 , 7. 또한, LKB1 자주 공동 변이 종양 KRA hypermetabolic 고 적극적인 인간 폐 종양8,9와 함께.
Lkb1 관련 질병 쉽게 쥐에서 모델링 됩니다. 쥐에서 Lkb1의 heterozygous 비활성화 잠 옷10,11,,1213를 정확 하 게 모델링 하는 hamartomas의 개발을 리드. 또한, Lkb1 돌연변이 생쥐에서 정확 하 게 모델링 쉽게 정리 폐, 피부, 췌 장, 유 방14의 암 고기. Cre recombinase 중재의 활성화를 Lkb1, 종양 KraG12D 대립 유전자 및 biallelic 삭제를 사용 하 여 유전자 변형 생쥐의 폐 조직에서 Kra/Lkb1의 공동 돌연변이 결과15 공격적이 고 전이성 폐 종양의 형성 ,16. KraG12D;의 특성 Lkb1-/- (KL) 폐 종양 생쥐에서 절연 보여줍니다 이러한 종양 높은 mTORC1 활성화는 매우 glycolytic, 포도 당 및 젖 산 염의 두 직접 대사 산물 측정을 사용 하 여 또는 [18F]의 소비를 측정-2- 플 루 오로-2-의하여-D-포도 당 (18F FDG) 양전자 방출 단층 촬영 (PET)와 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 17로. MTORC1 하이퍼-활성화 LKB1 돌연변이 종양에서 이러한 암을 치료 하는 mTOR의 allosteric 및 촉매 kinase 억제제 두 테스트에 대 한 명확한 근거를 제공 합니다.
이전 연구에서 우리는 allosteric mTORC1 억제제 rapamycin (RAPA)를 성공적으로 성장과 잠 옷3의 유전자 변형 마우스를 Lkb1+ 모델을 사용 하 여 위장 (GI) 종양에서 분해 저해 시연. RAPA 현재 신장 세포 암 치료에 대 한 단일 에이전트 요법으로 승인 하지만 NSCLC18,,1920에 제한 된 효능을 보였다. RAPA allosteric mTORC1 억제제 이며 mTOR 단지 1과 2의 더 많은 거의 완전 한 억제를 제공 하는 다음 세대 mTOR 촉매 kinase 억제제의 개발에 의해 향상 시킬 수 있습니다 (mTORC1와 mTORC2, 각각)21. MLN0128 같은 약은 지금 전 임상 연구 및 초기 단계 임상 시험22,23평가 되 고. 우리의 실험실에서 최근 연구는 MLN0128 이며 인간의 폐 종양 세포 라인에 강력한 mTOR 억제제에 vivo에서 폐 암15,16의 KL GEMMs에 증명. MLN0128이 쥐24폐 종양 성장 및 포도 당 대사를 억제.
이 연구에서 우리가 활용는 조건부로 활성화 oncogene Lox-정지-Lox-KRAG12D 15,25에서 시작 하는 폐암의 특징이 잘 adenoviral Cre 유도 마우스 모델. 이러한 KraG12D 마우스 마우스 데 floxed 대립 유전자 Lkb1의 교차 했다 (Lkb1L/L) KraG12D; 생성 하 Lkb1L/L (KL) 마우스16. Adeno-또는 lentivirus Cre recombinase 표현 intranasal 배달, 다음 KL 생쥐 초기 병 변 4 주 후 종양 유도 의해 개발. 6 주, 폐 carcinomas의 전형 더 악성, 공격적인 종양 형 용 종양에서 KL 마우스 변경에 종양 하 고 8-10 주 여, 쥐 100% penetrance16,26솔직 carcinomas 개발.
이미징 및 양적 immunohistochemistry 분자 및 대사 반응의 배달 다음 종양에서 치료 응답 확인 활용 될 수 있습니다 두 애완 동물/c T MLN012817, 등 치료 대상 26,27. 여기에 설명 된는 18F FDG 애완 동물을 이용 하는 실험 프로토콜 이미지 MLN0128 타겟 치료에 변화 응답을 측정 하기 위해입니다. 양적 조직학으로 애완 동물 이미징 커플링 mTOR 억제 분자 반응의 측정 뿐만 아니라는 종양 및 종양 조직학의 정량화를 수 있습니다.
이 문서 mTOR 억제제 MLN0128의 납품을 따라 폐 종양에 대사 및 분자 응답을 측정 하기 위해 qIHC와 18F FDG PET/CT 영상 활용 영상 기반 실험 방법을 설명 합니다. MLN0128는 종양에서 중요 한 변화 응답을 나타내는 18F FDG 소비를 효과적으로 감소. 연결 함으로써 PET/CT 영상 immunohistochemistry, 우리 공간 sectioned 종양 3D PET/CT 이미지를 등록 하 고 전체 종양 세포 및 분자 수준에서의 상세한 검사를 수행할 수 있었다. 이 MLN0128는 mTOR 신호, 종양에서 약에 대상 분자 응답 확인 저해 확인 가능 했다. 마지막으로, 양적 조직학을 활용 함으로써 매핑할 수 있었습니다 그리고 별도 뚜렷한 종양 병 리, 종양 괴 사에서 전체 종양 질량 같은 편평 세포 carcinomas에서 선 암 정의 microPET 이미징 보완.
MicroPET 현재 약 1 m m의 공간 해상도 의해 제한 됩니다. 또한, 18F FDG 보존 특정 조직에 플라스마 포도 당 수준, 종류 및 마 취 노출, 환경 온도, 그리고 영향을 줄 수 있는 동물의 일반적인 건강의 기간을 포함 하 여 다양 한 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 18 F FDG 약 동학30. 이러한 매개 변수는이 프로토콜에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 각 동물 모델에 대 한 최적화 되어야 합니다. 마우스에 피하 종양의 18F FDG 영상의 재현성 연구 보여 개별 마우스의 종양 치료 응답 18 에 의해 평가 하는 것을 건의 약 15%의 평균 %ID/g에 대 한 변동 계수 F FDG 애완 동물 안정적이 고 중요 한31간주이 임계값 보다 클 수 합니다.
애완 동물 추적기의 세포 및 subcellular 심지어 배포 이후에 얼룩이 지 고 qIHC 공동 등록 섹션 조직 autoradiography 하 여 평가 수 있습니다. CT와 공동 등록 애완 동물 허용 해 부 컨텍스트;에 넣어야 하는 애완 동물 이미지 이것은 낮은 부드러운 조직 대비로도 매우 중요 합니다. 자기 공명 영상 (MRI)와 CT에 의해 연부 조직 대조의 부족을 극복할 수 있습니다. 더하여, 형광 이미징에 대 한 생체 분해에서 vivo에서, 하지만 광자 흡수를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 및 폐 구멍에서 분산형 정확한 정량 또는 탐지 감도32에 영향을 미칠 수 있습니다. 요약 하자면, 양적 조직학으로 전체 동물 PET/CT 영상 활용 종양 생물학 치료 개입에 따라 정확 하 고 실시간으로 지도를을 제공 합니다.
Multispectral 이미징 (MSI) 컬러 이미지를 사용할 수 있습니다 어떤 상황 든 지에 적용 됩니다. 아주 최소한, MSI 컬러 이미지와 동일한 정보를 제공 하 고 일부 응용 프로그램에 대 한 MSI 간단한 광대역 3 색 (RGB) 이미지 보다 샘플의 스펙트럼 속성에 대 한 정보를 자세한 제공할 수 있습니다. 일반적으로, MSI의 한계는 그 컬러 이미징, MSI 느립니다와 이미지에 더 많은 시간이 걸립니다. 형태학 소프트웨어 그리고 이미지에 대 한 재현, 정확한 세분화 결과 얻기 위해 사용 재료의 테이블에서에서 설명. 조직 세분화 및 조직학의 정량화에 사용할 수 있는 추가 상용 제품이 있습니다.
복잡 한 암 대사는 바르 부르 크 효과 및 포도 당 물질 대사33,34넘어 확장 됩니다. 그것은 매우 가능성이 종양 분해를 억제 하는 단일 에이전트 치료에 쉽게 적응할 것 이다입니다. 암, 아미노산 대사에 대 한 잘 문서화 하 고 종양 자유 지방산35,36, 같은 다른 대사 산물 뿐 아니라 글루타민, 글리신, 떠들고, 등 amino acids에 의존으로 예상 된다 37. 18F FDG, 뿐만 아니라 18F-및 11C 레이블이 글루타민, 콜린, 아세테이트, 1-프로브 (2′-의하여-2′-fluoroarabinofuranosyl) 시 토 신 (포워드 액티브) 및 fluorothymidine (FLT) 성공적으로 사용 되었습니다 이미지 아미노산, 뉴클레오티드, 그리고 암38,39,,4041의 동물 모델에서 지질 물질 대사. 자동화 및 미 추적 radiochemistry 기술을 높은 해상도와 결합, 높은 감도 애완 동물 스캐너는 다양 한 생물학 절차42,43를 측정 하기 위한 애완 동물의 접근성을 향상 됩니다. 신진 대사 증가의 이해, 그것은 논리는 애완 동물 radiotracers의 레 퍼 토리 증가 뿐만 아니라, 연구자와 의사 noninvasively 프로필 종양 물질 대사를 활성화.
PET/CT 영상 및 정량 조직학의 활용 빠르게 임상 사용에 벤치 발견을 번역 하는 임상 필요를 해결 합니다. 이 위해 연구자는 PET/CT 영상 수 있습니다 마약에 인수 저항 뿐 아니라 치료 응답을 정확 하 게 측정 수 있어야 합니다. 또한, 폐 종양의 PET/CT 및 immunohistochemical 분석, 환자에서 치료의 표준으로 사용 된다는 직접 임상 연습으로 번역. 중요 한 것은, PET/CT 영상 쉽게 치료 저항 종양, 어떤 연구자 수 시키고 질병의 메커니즘을 이해 하기 위하여 분자 수준에서 심문을 식별 합니다. 이 가능 하 게 그것의 저항 메커니즘을 이해 하 고 임상 번역에 대 한 더 효과적인 치료 전략을 디자인 하는 반복적인 프로세스입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 캘리포니아 로스 앤젤레스 ‘ Crump Preclinical 이미징 기술 센터 그들의 도움에 대 한 쥐, 변환 병리학 핵심 연구소와 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 ‘ 통계 코어의 PET/CT 영상 대학 감사 데이비드 Geffen 학교의 의학 종양 샘플 준비와 분석 그들의 도움에 대 한. 자금, 데이비드 B. Shackelford는 CTSI에 의해 지원 되었다 및 KL2 변환 과학 상을 부여 번호 KL2TR000122 및 UL1TR000124는 데이비드 게 펜의과 대학에 ucla 그리고 여는 부의 방어 폐 암 연구 프로그램 변환 연구 제휴 W81XWH-13-1-0459 및 ACS RSG-16-234-01-TBG. 숀 T. 베일리는 데이비드 게 펜의과 ucla 통해 NIH T32 훈련 그랜트 HL072752에 의해 지원 되었다. 안토니 존스 UCLA 종양 세포 생물학 교육 프로그램 (USHHS 루스 L. Kirschstein 기관 국가 연구 봉사 상 # T32 CA009056)에 의해 지원 됩니다. Gihad Abdelhady는 NIH/NCI 다양성 보충 R01CA208642에 의해 지원 됩니다.
G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |