在本协议中, 我们描述如何利用 [18F]-2-氟 2-脱氧 d-葡萄糖正电子发射断层扫描和计算机断层扫描 (18MLN0128 PET/CT) 成像, 以测量肿瘤代谢反应的靶向治疗在Kras/Lkb1突变小鼠肺癌模型及高分辨率体外显影成像与定量组织学的结合。
晚期肿瘤的一个标志是转换到有氧糖酵解, 这是容易测量的 [18F]-2-氟-2-脱氧 d-葡萄糖正电子发射断层扫描 (18f-葡萄糖 PET) 成像。KRAS原癌基因和LKB1肿瘤抑制因子的共同突变是肺癌的常见事件, 驱动高代谢, 酵肿瘤的生长。调节这些肿瘤生长和代谢的关键途径是雷帕霉素 (mTOR) 通路的机械靶, 可以有效地利用选择性催化 mTOR 激酶抑制剂进行靶向。mTOR 抑制剂 MLN0128 抑制 Kras 和 Lkb1 共同突变的小鼠的糖酵解, 称为 KL 小鼠。对 KL 小鼠的治疗反应首先用18MLN0128 PET 和计算机断层扫描 (CT) 成像在分娩前后进行测量。通过利用18的 F 葡萄糖 PET/CT, 研究人员能够测量的动态变化的基因工程鼠模型 (GEMMs) 肺癌后的治疗干预与靶向治疗。其次是体外显影和定量免疫组化 (qIHC) 分析应用形态学软件。使用 qIHC 可以检测和量化的生物标志物的变化, 在治疗后, 以及独特的肿瘤病理特征的特点。PET 成像与定量组织学的耦合是在小鼠疾病模型中识别体内代谢和治疗反应的有效策略。
我们的研究重点是调查和针对癌症的突变在肝激酶 B1 (LKB1, 也称为 STK11) 突变体癌1。LKB1 是一个主要的肿瘤抑制物, 压抑 mTOR 复杂 1 (mTORC1) 通过活化的 AMP 激酶 (AMPK), 导致调节生长和新陈代谢。因此, LKB1 的丧失导致了无节制的 mTORC1 活化, HIF1-alpha 的活化产生于酵代谢表型, 通常称为华宝效应2,3,4。LKB1 失活突变直接导致了一种罕见的家族性癌症前置综合征, 称为黑斑-黑斑息肉病综合征 (睡衣), 其特点是良性胃肠息肉的发展称为错构瘤5,6,7. 此外, LKB1 经常与致癌 KRAS 共同变异, 导致高代谢和侵袭性人肺肿瘤8,9。
Lkb1-related 疾病在小鼠中很容易被模仿。Lkb1 在小鼠体内的异型灭活导致错构瘤精确建模睡衣10、11、12、13的发展。此外, Lkb1 突变, 易于建模的小鼠准确重述癌症表型的肺, 皮肤, 胰腺和乳房14。Kras/Lkb1 在转基因小鼠肺组织中的联合突变, 采用 recombinase 介导的致癌 KrasG12D等位基因活化和 biallelic 删除 Lkb1, 结果形成侵袭性和转移型肺肿瘤15 ,16。KrasG12D的表征;Lkb1 (KL) 小鼠肺肿瘤显示, 这些肿瘤具有较高的 mTORC1 活化和高度酵, 使用直接代谢物的葡萄糖和乳酸的测量或测量的消耗量 [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F 葡萄糖) 通过正电子发射断层扫描 (PET) 与计算机断层扫描 (CT) 17。LKB1 突变体肿瘤的 mTORC1 超活化为检测构和催化激酶抑制剂 mTOR 治疗这些癌症提供了明确的依据。
在前一项研究中, 我们证明构 mTORC1 抑制剂雷帕霉素成功地抑制了胃肠道肿瘤的生长和糖酵解, 使用Lkb1+/-转基因小鼠模型睡衣3。目前, 作为一种治疗肾细胞癌的单剂治疗方法, 现已被批准, 但在 NSCLC18、19、20中表现出有限的疗效。mTORC1 是一种构的抑制剂, 可以通过开发下一代 mTOR 催化激酶抑制剂来改善, 从而对 mTOR 配合物1和 2 (分别 mTORC1 和 mTORC2)21进行更接近完全的抑制。MLN0128 等药物目前正在临床前研究和22、23的早期试验阶段进行评估。我们实验室最近的一项研究表明, MLN0128 是 mTOR 在肺癌 GEMMs15、16的人肺肿瘤细胞系和体内的一种有效抑制剂。MLN0128 抑制了这些小鼠的肺肿瘤生长和葡萄糖代谢24。
在本研究中, 我们利用有条件活化的液氧-停止-液-KRASG12D癌基因15,25引发肺癌的典型的腺病毒诱导小鼠模型。这些 KrasG12D小鼠与有 floxed 等位基因的小鼠交叉, Lkb1 (Lkb1l) 产生 KrasG12D;Lkb1l/升(吉隆坡) 小鼠16。在 recombinase 的腺或慢病毒北疆的鼻腔传递后, KL 小鼠在肿瘤诱导后4周内形成早期病变。6周后, KL 小鼠的肿瘤从性腺瘤肿瘤转变为典型的肺癌的恶性、侵袭性肿瘤表型, 8-10 周, 小鼠以100% 显性16,26, 发展为弗兰克癌。
PET/CT 成像和定量免疫组化可用于确定的分子和代谢反应, 以及治疗反应, 在肿瘤后交付的靶向治疗, 如 MLN012817, 26,27。这里描述的是一个实验性的协议, 利用18f-葡萄糖 PET 成像测量代谢反应的 MLN0128-targeted 治疗。通过定量组织学耦合 PET 成像, 可以测量 mTOR 抑制的分子反应以及肿瘤负担和肿瘤组织学的定量。
本文描述了一种基于成像的实验方法, 利用18的 qIHC PET/CT 成像与 mTOR, 以测量在肺肿瘤的代谢和分子反应后, 交付的 MLN0128。MLN0128 有效地降低了18的葡萄糖摄入量, 表明肿瘤有很大的代谢反应。通过将 pet/ct 成像与免疫组化相结合, 我们能够在3D 的 pet/ct 图像上对切片肿瘤进行空间记录, 并对细胞和分子水平的整个肿瘤进行详细检查。这使得有可能证实 MLN0128 抑制 mTOR 信号, 从而确认对肿瘤药物的靶向分子反应。最后, 利用定量组织学, 我们能够映射和分离不同的肿瘤病理, 如肿瘤的整体肿瘤肿块, 从鳞状细胞癌定义腺癌, 并补充 microPET 成像。
MicroPET 目前受空间分辨率的限制, 约为1毫米。此外, 在某些组织中的18F 葡萄糖保留可能受各种因素的影响, 包括血糖水平, 麻醉暴露的类型和持续时间, 环境温度和动物的一般健康, 这可能影响18葡萄糖药代动力学30。这些参数已针对该协议进行了优化, 但应针对每个动物模型进行优化。小鼠皮下肿瘤18f-葡萄糖成像的重现性研究表明, 平均%ID/g 的变异系数约为 15%, 表明单个小鼠的肿瘤治疗反应为18F-葡萄糖 PET 应该大于这个阈值被认为是可靠的和显著的31。
PET 示踪剂的细胞和甚至亚型分布可以通过组织显影来评估, 随后的切片染色并与 qIHC 共同注册。用 CT 联合注册 pet 可以将 pet 图像置于解剖环境中;这是非常宝贵的, 即使低软组织对比度。磁共振成像 (MRI) 可以克服 CT 对软组织造影的缺乏。此外, 荧光成像的生物标志物可以用来评估体内的糖酵解, 但在肺腔内的光子吸收和散射可能影响准确的定量或检测灵敏度32。总之, 利用全动物 PET/CT 图像定量组织学提供了一个准确的实时地图的肿瘤生物学治疗干预。
多光谱成像 (MSI) 适用于可能使用彩色图像的任何情况。至少, msi 提供了与彩色图像相同的信息, 对于某些应用程序, msi 可以提供比简单的宽频带三色 (RGB) 图像更详细的样本光谱属性信息。通常, msi 的局限性是彩色图像的限制, 只是 msi 速度较慢, 需要更多的时间来获取图像。利用形态学软件对图像进行重现、准确的分割结果, 并在材料表中进行了描述。还有额外的商用产品, 可用于组织分割和定量的组织学。
癌症代谢的复杂性超出了华宝效应和葡萄糖代谢33,34。肿瘤很可能会轻易地适应单一的药物治疗, 抑制糖酵解。对氨基酸代谢的依赖已经在癌症中得到了很好的记录, 预计肿瘤依赖于大量的氨基酸, 如谷氨酰胺, 甘氨酸, 丝氨酸, 以及其他代谢物, 如游离脂肪酸35,36, 37。除了18f-葡萄糖, 探针, 如18f 和11C 标记谷氨酰胺, 胆碱, 醋酸盐, 1-(2 ‘-脱氧-2 ‘-fluoroarabinofuranosyl) 胞嘧啶 (外交事务) 和氟胸苷 (外语教学) 已成功地用于图像氨基酸,核苷酸和脂质代谢的动物模型的癌症38,39,40,41。自动化和微型示踪放射化学技术加上高分辨率, 高灵敏度 pet 扫描仪将提高 pet 的可达性, 用于测量各种生物程序42,43。随着对新陈代谢的理解的增加, 宠物 radiotracers 的汇辑也将增加, 使研究人员和医生能够无创性肿瘤代谢的分布。
利用 PET/CT 成像和定量组织学解决了临床需要, 这是快速翻译板凳发现到临床使用。为了做到这一点, 研究人员必须能够准确地测量治疗反应以及获得的药物的抗性, 这是 PET/CT 成像所能实现的。此外, 对肺肿瘤的 PET/CT 和免疫组化分析作为患者的护理标准, 可直接翻译为临床实践。重要的是, PET/CT 成像容易识别治疗抗肿瘤, 研究人员可以在分子水平上隔离和审问, 以便更好地了解疾病的机制。这是一个迭代的过程, 使它能够更好地了解抗药性的机制和设计更有效的治疗策略, 为临床翻译。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢加州大学洛杉矶分校的克伦普临床前成像技术中心, 帮助他们的宠物/CT 影像的小鼠, 翻译病理核心实验室和统计核心在加利福尼亚大学洛杉矶 ‘大卫. 格芬医学院为他们的协助与肿瘤标本的制备和分析。为供资, 大卫 b. 沙克尔福德得到了 CTSI 和 KL2 翻译科学奖赠款号码 KL2TR000122 和 UL1TR000124 在加州大学洛杉矶分校医学院和国防部肺癌研究计划的翻译研究伙伴关系 W81XWH-13-1-0459 和 ACS RSG-16-234-01-TBG。肖恩 t. 贝利得到了 NIH T32 训练补助金 HL072752 通过加州大学洛杉矶分校医学院。安东尼. 琼斯得到了加州大学洛杉矶分校肿瘤细胞生物学训练计划 (USHHS Kirschstein 机构国家研究服务奖 T32 CA009056) 的支持。Gihad Abdelhady 由 NIH/癌症多样性补充 R01CA208642 支持。
G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |