É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.
Transplante de ilhotas tem sido proposto para ser um potencial tratamento para o diabetes tipo 1. Recentes evidências indicam que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal e, portanto, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de ilhotas. Esse experimento requer o isolamento de ilhotas de alta qualidade e a implantação dos ilhéus aos destinatários diabéticos. Transplante para o omento requer etapas cirúrgicas que podem ser melhor demonstradas visualmente. Aqui, as etapas detalhadas para este procedimento são apresentadas. Dois métodos de misturar as ilhotas isoladas com hidrogel antes de colocar a mistura dentro da bolsa omental de ratos diabéticos são descritos aqui. Hidrogel diferentes é utilizados para as diferentes condições. Níveis de glicose de destinatários de rato diabético de ilhotas syngeneic no omento foram monitorados por até 35 dias. Alguns animais foram sacrificados após 14 dias para realizar a análise imuno-histoquímico. Esta abordagem pré-clínico de transplante pode ser usada como dados preliminares que antecederam a tradução para transplante clínico.
De acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF), o diabetes mellitus afeta atualmente 382 milhões de pessoas, com um aumento previsto de 592 milhões de pessoas por 20351. Em ambos os transplante alogênico e xenogénica ilhéu, terapia imunossupressora sistêmica é necessária. Sem imunossupressão, imune a rejeição é das principais causas de perda de enxerto2. Há também um problema significativo de perda de ilhéu transplantado devido o sangue instantânea mediada por reação inflamatória (IBMIR)3,4. No entanto, mesmo na ausência de uma resposta imune, tal como em syngeneic ou modelos de autotransplante, células das ilhotas transplantadas para o fígado através da veia porta são perdidas devido à inflamação e/ou a condições ambientais desfavoráveis, tais como sangue pobre fornecer com oxigenação reduzida e/ou nutrientes5,6. Como resultado, para assegurar a função metabólica a longo prazo, os números mais altos da ilha são necessários para compensar a perda de célula inicial que reduz a enxertia7.
Na tentativa de otimizar a enxertia ilhéu, vários sítios anatômicos alternativos têm sido investigados experimentalmente bem como clinicamente, com promissor, ainda não definitiva resulta8. Considerando que alguns dos sites alternativos oferecem acesso fácil e seguro (ex., pele, cápsula renal, submucosa gástrica e câmara anterior do olho) ou uma superfície mais ampla para maiores massas ilhéu (EG., cavidade peritoneal), sobrevivência e fisiológica performance metabólica dos ilhéus transplantados ainda são limitado e permanecem uma preocupação9. A busca de um local mais apropriado para enxertia Ilhéu está em curso.
O omento estava entre os muitos sites anatômicos que foram investigados no desenvolvimento precoce do transplante de ilhotas e provou ser um ambiente bem sucedido para Ilhéus10,11,12,13, 14. No entanto, infusão intraportal ilhota tornou-se o clínico escolha devido em parte para a relativa simplicidade do procedimento e6modelos de sucesso precoce no animal. Também, em parte, os negativos associados com este site, particularmente maciça perda precoce do Ilhéu, eram menos compreendido e menos a restrição nos primeiros dias do transplante de ilhotas experimental como o campo amadureceu. Com as mais recentes evidências indicando que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de células.
O omento (sob a forma de uma bolsa omental) oferece vantagens relativas sobre o fígado15,16. É facilmente acessível e bem vascularizado. Permite a recuperação do enxerto (se necessário) e/ou biópsia. O período isquêmico vivido por Ilhéus é reduzido em comparação com o fígado, e o omento pode aceitar relativamente massas ilhéu grande, que não é possível intraportally, onde um aumento da pressão portal podem causar complicações.
Um modelo de mouse syngeneic de transplante foi usado no protocolo testado no estudo, empregando camundongos C57BL/6 do sexo masculino entre 6-8 semanas de idade com um peso corporal de 20 – 25 destinatários do Ilhéu de g. foram renderizados diabéticos com uma única injeção de estreptozotocina com uma dose de 250 mg/kg ip. A indução do diabetes pode ser considerada bem sucedida se o nível de glicose do sangue do rato é maior que 24 mmol/L 48 h após a injeção e permanece acima desse nível por um período mínimo de 5 dias.
Syngeneic ilhéus foram isoladas a partir do pâncreas de doadores de idade-combinadas seguindo métodos publicados anteriormente, com algumas modificações. Em breve, a colagenase foi injetado a vesícula em vez do ducto biliar. Isso foi feito como uma melhoria para facilitar a facilidade de injeção. Infusão de colagenase foi seguido de incubação, rompimento de tecido, separação de gradiente de densidade e de mão-colheita para obter puras ilhotas. Ilhéus foram cultivados durante a noite em CMRL-1066 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) em balões T175 a 37 ° C, abaixo dos 95% ar – 5% CO2 antes do transplante.
Transplante de ilhotas no fígado através da veia portal é o método mais usado de transplante de ilhotas em seres humanos, mas ainda existem preocupações de segurança e eficiência como a veia porta-trombose e fígado esteatose17. Estudos recentes mostram que o omento pode ser uma alternativa adequada para o fígado, mas mais pesquisa precisa ser realizada antes da tradução clínica12,14,18,<…
The authors have nothing to disclose.
Alguns dos autores deste trabalho foram apoiados em parte por concessões do nacional chave R & D programa de China (2017YFC1103704), projeto de Sanming de medicina em Shenzhen (SZSM201412020), fundo para alto nível médico disciplina construção de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fundação de ciência e tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fundação de Shenzhen, da saúde e da Comissão de planejamento familiar (SZXJ2017021).
Equipment | |||
5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
razor blade | Philips | HC1099/15 | |
Material and animals | |||
Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
T175 flasks | Falcon | 353112 | |
1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |