Een methode voor de omental transplantatie van de eilandjes in een muis is ingevoerd. De geïsoleerde eilandjes met hydrogel zijn gemengd en het mengsel wordt geplaatst in de omental etui van een diabetische muis. Vervolgens de bloedglucose wordt gecontroleerd en immuno-histochemische analyse wordt uitgevoerd.
Islet Transplantatie is voorgesteld als een mogelijke behandeling voor diabetes type 1. Recente overtuigend bewijs geeft aan dat intravasculaire islet infusie verre van ideaal is en de majus daarom opnieuw opkomende als een potentieel waardevolle site voor islet transplantatie. Dit experiment vereist het isolement van hoge kwaliteit eilandjes en de inplanting van de eilandjes aan de diabetische ontvangers. Transplantatie aan de majus vereist chirurgische stappen die kunnen beter visueel worden aangetoond. Hier is de gedetailleerde stappen voor deze procedure worden gepresenteerd. Twee methoden voor het mengen van de geïsoleerde eilandjes met hydrogel voor het plaatsen van het mengsel in het omental zakje van diabetesmuizen worden hier beschreven. Verschillende hydrogels worden gebruikt voor de verschillende omstandigheden. Niveaus van de glucose van het bloed van syngeneic kleine eilandjes in de majus gegevensontvangers diabetische muis werden gevolgd tot maximaal 35 dagen. Sommige dieren werden opgeofferd na 14 dagen naar immuno-histochemische analyses uit te voeren. Deze aanpak van de pre-klinische transplantatie kan worden gebruikt als voorlopige gegevens aanloop naar vertaling naar klinische transplantatie.
Volgens de internationale Diabetes Federatie (IDF), diabetes mellitus is momenteel invloed op 382 miljoen mensen, met een verwachte toename 592 miljoen mensen van 20351. In beide allogene en XENOGENECELLEN islet transplantatie is systemische immunosuppressieve therapie noodzakelijk. Zonder immunosuppressiva is immuun afwijzing een belangrijke oorzaak van graft verlies2. Er is ook een groot probleem van getransplanteerde islet verlies als gevolg van de onmiddellijke bloed gemedieerde inflammatoire reactie (IBMIR)3,4. Echter, zelfs in de afwezigheid van een immuunrespons zoals syngeneic of auto-transplantatie modellen, in de lever via de portal vein getransplanteerd eilandjecellen verloren gaan als gevolg van ontsteking en/of aan ongunstige omgevingsfactoren, als arme bloed voorzien van verminderde oxygenatie en/of nutriënten5,6. Dientengevolge, met het oog op een langdurige metabole functie, zijn hogere islet nummers nodig om te compenseren voor het verlies van de oorspronkelijke cel dat engraftment7 vermindert.
In een poging om het eilandje engraftment optimaliseren, verschillende alternatieve anatomische sites experimenteel zijn onderzocht, evenals klinisch, met veelbelovende, nog geen definitieve resultaten8. Overwegende dat sommige van de alternatieve sites bieden een gemakkelijke en veilige toegang (bv., huid, nieren, maag submucosa en de capsule anterior kamer van het oog) of een groter oppervlak voor grotere islet massa (bv., peritoneale holte), overleven en fysiologische metabole prestaties van de getransplanteerde eilandjes zijn nog steeds beperkt en blijven een zorg-9. Het zoeken naar een meer geschikte plaats voor islet engraftment loopt.
De majus was een van de vele anatomische sites die werden onderzocht in de vroege ontwikkeling van islet transplantatie, en bleek een succesvolle omgeving voor eilandjes10,11,12,13, 14. Echter, intraportal islet infusie werd de klinische keuze due gedeeltelijk aan de relatieve eenvoud van de procedure en vroege succes in dierlijke modellen6. Ook, gedeeltelijk, de negatieven die is gekoppeld aan deze site, met name massale vroege islet verlies, waren minder begrepen en minder beperken in de vroege dagen van de experimentele islet transplantatie als het veld verviel. Met meer recente dwingende aanwijzingen waaruit blijkt dat intravasculaire islet infusie verre van is ideaal, de majus is opnieuw opkomende als een potentieel waardevolle site voor transplantatie van de cel.
De majus (in de vorm van een omental zakje) biedt relatieve voordelen ten opzichte van de lever15,16. Het is goed gevacuoliseerd en gemakkelijk toegankelijk. Het kunt ophalen van de prothese (indien nodig) en/of een biopsie. De ischemische periode ervaren door de eilandjes is verminderd in vergelijking met de lever en de majus kan relatief grote islet massa die niet mogelijk in de intraportally, waar een stijging van de portal druk kunnen leiden tot complicaties.
Een syngeneic muismodel van transplantatie werd gebruikt in het protocol getest in de studie, dienst C57BL/6 mannelijke muizen tussen 6-8 weken oud met een lichaamsgewicht van 20 – 25 g. Islet ontvangers werden weergegeven met een enkele injectie van streptozotocin met een dosis van 250 diabetische mg/kg ip. De inductie van diabetes kan succesvol worden beschouwd als de bloedglucose niveau van de muis meer dan 24 mmol/L 48 h na injectie is en boven dat niveau voor een minimum van 5 dagen blijft.
Syngeneic eilandjes werden geïsoleerd uit de alvleesklier van leeftijd-matched donoren volgende eerder gepubliceerde methoden met enkele wijzigingen. Kortom, werd de collagenase geïnjecteerd in de galblaas in de plaats van de koker van de gal. Dit werd gedaan als een verbetering ter vergemakkelijking van het gemak van injectie. Collagenase infusie werd gevolgd door incubatie, verstoring van het weefsel, dichtheid verlopende scheiding en hand-picking te verkrijgen pure eilandjes. Eilandjes werden ‘s nachts gekweekt in CMRL-1066 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) in T175 kolven bij 37 ° C, onder 95% lucht – 5% CO2 vóór de transplantatie.
Islet transplantatie aan de lever via de portal-ader is de meest gebruikte methode van islet transplantatie bij de mens, maar er zijn nog steeds zorgen voor efficiëntie en veiligheid zoals portal veneuze trombose en lever steatosis17. Recente studies tonen aan dat de majus mogelijk een geschikt alternatief voor de lever, maar er moet meer onderzoek worden verricht voorafgaand aan klinische vertaling12,14,18</s…
The authors have nothing to disclose.
Enkele van de auteurs van dit werk werden deels gesteund door subsidies van nationale toets R & D programma van China (2017YFC1103704), Sanming Project van geneeskunde in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds voor hoog niveau medische Discipline bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Stichting voor wetenschap en technologie (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Stichting van gezondheid en gezinsplanning Commissie (SZXJ2017021).
Equipment | |||
5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
razor blade | Philips | HC1099/15 | |
Material and animals | |||
Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
T175 flasks | Falcon | 353112 | |
1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |