Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.
Microglía representan el 5-10% de todas las células del sistema nervioso central (SNC) y son cada vez más llamar la atención debido a sus contribuciones durante el desarrollo, homeostasis y enfermedad. Aunque los macrófagos han sido estudiados en detalle por décadas, características especializadas de la microglía, los macrófagos residentes de tejido del SNC, se han mantenido en gran parte misteriosa, en parte debido a las limitaciones en la capacidad para recapitular microglial maduro propiedades en la cultura. Aquí ilustramos un sencillo procedimiento para el aislamiento rápido de puro microglia del cerebro de roedores maduros. También describimos las condiciones de cultivo libre de suero que soportan altos niveles de microglial viabilidad con el tiempo. Microglia cultivada bajo estas condiciones del medio definen exhiben elaborados procesos ramificados y comportamiento dinámico de la vigilancia. Ilustramos algunos efectos de la exposición del suero en microglia cultivada y discutir cómo estas culturas sin suero comparan culturas expuestas al suero, así como microglia en vivo.
Como los macrófagos de la parenquimia del CNS, microglia interactuar con una amplia gama de circuitos neuronales y gliales redes de señalización. Desempeñan funciones vitales en el desarrollo y homeostasis del cerebro a través de la poda sináptica, separación de células apoptotic y transitorias interacciones con procesos neuronales1,2. Microglia son primeros respondedores a lesiones neurológicas, ampliando sus procesos de largas y delgadas a los sitios de lesión para coordinar las respuestas inflamatorias y limitar el sangrado3,4. Cambios en la morfología de microglial y función son ubicuos en lesiones CNS agudas y crónicas, y microglia exposición altera morfología, localización y expresión de mediadores inflamatorios en una amplia gama de Estados de enfermedad1. Estudios genéticos en humanos indican que las mutaciones que alteran el riesgo de enfermedades neurodegenerativas son a menudo predominantemente o exclusivamente expresadas por microglia del sistema nervioso intacto, apuntando hacia un papel crítico para la microglia en la patogénesis de la enfermedad o progresión de la5 . Dada su prominencia en accidentes y enfermedades, favorecer la comprensión de la biología de microglial es una alta prioridad para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.
Han surgido muchos avances fundamentales para la comprensión de la biología de microglial extrapolando mecanismos descubiertos en estudios de otras poblaciones de macrófagos incluyendo métodos de cultivo, perfiles de expresión génica y definiciones funcionales y técnicas / morfológicas Estados. Aunque generalizado macrófago funciones a menudo juegan de manera sorprendente dentro del panorama de la CNS, microglía son altamente especializados, exhiben una morfología ramificada y una firma de expresión de gen único que les diferencia de otros tejidos los macrófagos6. Microglia tienen un linaje que es distinto de la mayoría de los otros macrófagos; colonizar el SNC durante una temprana ola embrionaria de hematopoyesis primitiva y uno mismo-renovar toda la vida, independiente de las contribuciones de hematopoyesis definitiva7. La firma de expresión de gen completamente maduros de microglia adultos no se logra hasta la segunda semana postnatal8. Señales ambientales del tejido circundante juegan un papel importante en el dictado de macrófagos de tejido-específica características6, que en el SNC incluye exposición limitada a factores transmitidos por la sangre por la barrera hemato – encefálica9.
Un obstáculo para comprender plenamente microglial contribuciones a CNS homeostasis y enfermedad es la dificultad de recapitular las propiedades especializadas de microglia madura visto en vivo con células purificadas en vitro. Muchos métodos han sido desarrollados para aislar y microglia intacta de la cultura, pero la mayoría de enfoques dependen de suero para apoyar la supervivencia de la célula. Hemos demostrado que además del suero, que es un reactivo inherentemente variable que contiene una gran variedad de moléculas bioactivas, es particularmente problemático cuando trabajo con microglia ya que promueve una morfología ameboides, incrementa la proliferación, y aumento de fagocitosis9 a menudo visto en vivo cuando microglía están expuestos a factores de sangre después de la interrupción de la barrera blood – brain. De estas métricas, expuestas al suero de las células se asemejan a microglia en lesiones o enfermedades, pero tales alteraciones se reducen cuando microglia se cultivan en el medio de crecimiento definido con CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterol y selenita.
Este protocolo proporciona información detallada para el cultivo de rata juvenil microglia en condiciones libres de suero, relacionados con la obra recientemente publicada9. Este protocolo se ha racionalizado para las ratas de día postnatal 21-30 (P21 – P30), pero puede ser adaptado para aislar microglia de ratas y ratones de cualquier edad, aunque el rendimiento y la viabilidad general varían dependiendo de la especie y edad del animal. Máximo rendimiento y viabilidad óptima se logra cuando se usa ligeramente inmaduro microglia (~ P9), con rendimientos y viabilidad estrechándose gradualmente a algo de niveles más bajos en animales adultos. Microglía también puede ser aislado de ratones, pero hemos encontrado que las células de rata muestran significativamente mayor rendimientos, viabilidad y la complejidad de la morfología ramificada, en comparación con las células de ratón en cultivos libres de suero. Animales de edad superior a P50 no han sido evaluadas con este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de immunopanning ha sido optimizado para reducir al mínimo cambios en perfiles transcripcionales microgliales durante el aislamiento y para maximizar la viabilidad posterior de las células. Usando estas técnicas y formulaciones de los medios de comunicación, cultivos primarios de alta viabilidad pueden mantenerse por semanas. Microglia cultivada bajo estas condiciones presentan una morfología muy ramificada con rápida extensión y retracción de los procesos y relativamente bajas tasas de proliferación. Resaltar la importancia de suero-exposición de estas características y discutir las fortalezas y debilidad de este método en comparación con otros enfoques.
Porque microglia sirva de centinela de las células inmunes de la CNS, son altamente sensibles a los cambios ambientales; por lo tanto, se requiere gran cuidado para reducir al mínimo las respuestas inflamatorias dentro de las células durante el aislamiento y cultura8. Esto se logra en este protocolo a través de la velocidad y la temperatura. Mantener las células en hielo o a 4 º C siempre que sea posible reduce la activación, por lo que realizará todos los pasos de centrifugación a 4 ° C…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Christopher y Dana Reeve Foundation internacional Consorcio de investigación en lesión de la médula espinal, el Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fundación de JPB, el Instituto Novartis de investigación básica, generosas contribuciones de Vicente y Stella Coates y Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).
Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stock reagents | |||
Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
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N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
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Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
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TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
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Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | |||
Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
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Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
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Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
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Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
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TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |