ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット ミクログリアの堅牢な生存を維持するために設計された分離と培養手法を指します。
ミクログリアは、中枢神経系 (CNS) のすべてのセルの 5-10% を表し、開発、恒常性と病の間に彼らの貢献のための注目に高まっています。マクロファージは、数十年、ミクログリアの特殊な機能、中枢神経系の組織に常駐マクロファージの詳細研究されてきたが大きく神秘的な成熟したミクログリアを要約する能力の制限により一部に残っています。文化のプロパティ。ここでは、私たちは成熟した齧歯動物の脳から純粋なミクログリアの急速な隔離のための簡単な手順を示しています。時間をかけてミクログリア生存率の高レベルをサポートする無血清培養条件についても述べる。これら定義培地条件下で培養したミクログリア精巧な区分されたプロセスと動的監視行動を表わします。我々 は議論するどのミクログリアの生体内と同様、両方の文化の血清露出に比較してこれらの無血清培養および培養マイクログリアに及ぼす血清露出を示しています。
中枢神経系の柔組織のマクロファージ、ミクログリア神経回路とグリア細胞のシグナリング ネットワークの広大な配列と通信します。彼らは開発およびシナプスの刈り込み、アポトーシス細胞のクリアランスと神経突起1,2で一時的な相互作用を介して脳の恒常性の重要な役割を果たします。ミクログリアは、病変部に炎症性応答を調整し出血の3、4を制限する彼らの長い、細いプロセスを拡張する神経学的な傷害に初期応答です。ミクログリアの形態と機能の変化は、急性および慢性の両方の中枢神経系傷害、ユビキタス、ミクログリア展示変更形態、ローカリゼーション、および多様な疾患状態1中の炎症メディエーターの発現。人間の遺伝学的研究を示す神経変性疾患のための危険を変える突然変異は、病気の発症や進行5 におけるミクログリアの重要な役割を指して、そのまま中枢神経系におけるミクログリアによって表現頻繁に主にまたは専らこと.けがや病気の彼らの卓越性を与えられた、新しい治療上のアプローチを開発するための高い優先度は、ミクログリアの生物学の理解を促進します。
ミクログリアの生物学の理解には多くの重要な進歩はテクニックとメカニズム他マクロファージを培養、遺伝子発現プロファイル、および機能の定義を含む集団の研究で発見された推定することによって生じています。形態/状態。マクロファージ機能しばしば中枢神経系ランドス ケープ内で意外な方法で再生を一般化、ミクログリアは自分自身、専門性の高い、分岐された形態および他の組織から離れてそれらを設定するユニークな遺伝子発現シグネチャを出展マクロファージ6。ミクログリアは他のほとんどのティッシュの大食細胞の異なる系統があります。彼らは原始造血の初期胚性波の中に中枢神経系を植民地化し、自己決定的な造血7からの貢献の独立した、生涯更新します。大人マイクログリアの完全に成熟した遺伝子発現シグネチャは、第 2 の8の生後週まで達成されていません。周囲の組織から環境の手がかりは、組織固有のマクロファージ機能6、中枢神経系血液脳関門9によって与えられた血液媒介要因への限られた露出を含むを口述筆記で主要な役割を果たします。
完全にミクログリアへの中枢神経の恒常性や病気を理解するための 1 つの障害が見られる成熟したミクログリア体内浄化された細胞の特殊なプロパティをさたの難しさ体外。分離する多くの方法が開発されている、文化そのままミクログリアがほとんどアプローチ細胞生存率をサポートするための血清に依存します。生理活性分子の広大な配列を含む本質的に変数の試薬は、ミクログリアの操作それはアメーバの形態を促進するため増加増殖は、特に問題となる、血清を加えている示されていると貪食亢進9は、ミクログリアが血液血液-脳関門の破壊後の要素にさらされる生体内でよく見かけます。これらのメトリックによって血清曝露細胞は、けがや病気の状態、ミクログリアを似ていますが、このような変化を減少しているミクログリアを亜セレン酸、コレステロール、TGF-β 髄液 1 (または IL-34) を含む定義された成長培地で培養すると。
このプロトコルは、最近出版された仕事9に関連する無血清条件下で幼若ラット ミクログリアを培養するための詳細を提供します。このプロトコルは、ラット生後 21-30 (P21 – P30) より合理化されていますが、収量および全体的な生存率は種および動物の年齢によって異なりますがラットおよびあらゆる年齢のマウスのミクログリアの分離に適応することができます。最大利回りし、若干未熟なミクログリアを使用するときに最適な生存を達成 (~ P9)、利回りと徐々 に先を細くやや大人動物の下位レベルの生存率。ミクログリアはマウスから分離することができますが、我々 はラットの細胞を示す有意に高い利回り、実行可能性、および分岐された形態の複雑さ無血清培養マウス細胞と比較して発見しました。動物が P50 より大きい高齢者このプロトコルで評価されていません。この immunopanning の分離のプロシージャは分離中ミクログリア転写プロファイルの変化を最小限にしてセルの下流の可能性を最大化する最適化されています。これらの技術とメディアの製剤を使用して、週間高生存率初代培養を維持できます。これらの条件下で培養したミクログリアは急速な拡張とプロセスの撤回を含む高度分岐し形態を展示し、増殖率が比較的低い。これらのプロパティの血清露出の意義を強調し、他のアプローチと比較してこの方法の長所と短所を話し合います。
ミクログリアは、sentinel 中枢神経系の免疫担当細胞として機能するため、環境の変化に非常に敏感したがって、分離、文化8時に細胞内での炎症反応を最小限に抑えるため細心の注意が必要です。これは、速度と温度をこのプロトコルで実現されます。動物は冷たい血流バッファーと灌流し、組織の間の時間を最小限に抑えるために合理化されましたプロトコルまたは 4 ° C ?…
The authors have nothing to disclose.
この作品はクリストファーと脊髄損傷、博士ミリアムとシェルドン g. アデルソン医療研究財団、JPB、ノバルティス研究所の基礎研究、ダナ リーブ財団国際研究コンソーシアムによって支持されました。デイモン ・ ラニアンがん研究振興財団 (DRG-2125-12) とステラ ・ コーツ、ヴィンセントからの寛大な貢献。
Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stock reagents | |||
Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
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N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
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Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
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TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
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Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | |||
Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
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Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
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Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
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Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
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TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |