تجفف الدم والبقع المصل كأداة مفيدة لتخزين نموذج لتقييم المؤشرات الحيوية السرطان
Summary
ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومفيدة لتخزين الدم المحيطي والمصل/بلازما لتحليلات المصب مثل النوكليوتيدات واحدة تعدد الأشكال (SNP) تقييم وفحص إليزا.
Abstract
جودة عينة الدم أمر حاسم لضمان دقة التحاليل المصب مثل PCR الوقت الحقيقي أو أليسا. التخزين الصحيح للمواد البيولوجية هو نقطة الانطلاق لتحقيق النتائج استنساخه وموثوق بها. ينبغي أن يعامل جميع العينات بنفس الطريقة من جمع الدم للتخزين. اعتماداً على التحليلات التي يتعين القيام بها، يجب تخزين الدم كله وعينات المصل في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. وينبغي أيضا عينات مصل الدم/الكوتيد لتجنب ذوبان التجميد متعددة. مسألة هامة أخرى هي شروط عينة أثناء الشحن من معمل واحد إلى آخر. إذا لم يتوفر الثلج الجاف أو الشحنة وقتاً أطول من بضعة أيام، هناك حاجة النهج البديلة. خيار واحد استخدام ورق الترشيح لجمع الدم. هنا، فإننا نقترح أسلوب للدم وجمع عينة المصل الذي يستفيد من المجففة بقع الدم (DBS) والمجفف البقع المصل (DSS). قمنا بتطوير الإجراءات استخراج الحمض النووي من DBS لتقييم بعض النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) المتلقين للمعلومات بالوقت الحقيقي PCR. ونحن أيضا الأمثل مقايسة أليسا بدءاً من البروتينات التيد من مفاجآت. يمكن استخدام هذا الأسلوب مع أليسا فحوصات أو إجراءات تقييم البروتينات الأخرى.
Introduction
والهدف الرئيسي للبحث في السرطان المؤشرات الحيوية هو تحديد البارامترات البيولوجية الجديدة التي يمكن استخدامها لتشخيص لتشخيص المريض التنبؤ لتحديد ما إذا كان مريض سوف تستجيب لعلاج محدد. هذا المجال البحوث الأساسية لاكتشاف علاجات السرطان مبتكرة ويلعب دوراً رئيسيا في العلاج مصممة خصيصا.
يجب أن تكون الإجراءات التي نفذت خلال كل خطوة وتحديد العلامات البيولوجية والتحقق من صحة موثوقة واستنساخه. هو حجر زاوية في نجاح البحوث متعدية التخزين الصحيح للعينات البيولوجية مثل الدم والمصل. هذه هي الخطوة الأولى نحو الحصول على جودة عالية من المواد البيولوجية التي يمكن استخدامها لإجراء تجارب البيولوجيا الجزيئية أو فحوصات البروتين.
دراسات متعددة المراكز غالباً ما يلزم لتجنيد ما يكفي من المرضى للحصول على بيانات قوية. ليست كل المعاهد قادرة على تخزين العينات في-80 درجة مئوية أو إرسال عينات إلى المراكز الدولية الأخرى في الثلج الجاف. استخدام ورق الترشيح لجمع الدم هو طريقة بسيطة لتخزين الدم والمصل ولا تتطلب التجميد الفوري لعينات1،2. يمكن رصدها قطره من الدم أو المصل على الورق، غادر إلى الجافة بين عشية وضحاها، وثم تخزينها لمدة تصل إلى 14 يوما في درجة حرارة الغرفة1،2. وهذا يعطي الباحثين الوقت لإرسال العينات إلى مختبرات أخرى. استخدام الدم المجفف البقع (DBS) والبقع المصل المجففة (DSS) وبالتالي يمكن تبسيط التعاون بين المعاهد في البلدان المتقدمة والنامية.
نظراً لسهولة استخدامه، أخذ العينات DBS يستخدم على نطاق واسع في عدة أنواع من الاختبارات المصلية أو الوراثية بتحليل المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، في الماضي، كثيرا ما كانت المستخدمة DBS لفيروس نقص المناعة البشرية الفرز في البلدان النامية1،2،3،،من45. وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب التخزين أنه يمكن جمع عينات دم من يحرك الإصبع، مما يمكن استعماله للأطفال حديثي الولادة فحص الاختبارات 6،،من78. العينة سهلة المناولة والنقل زيادة مزايا DBS، خاصة بالنسبة للعينات التي تم جمعها في المواقع النائية حيث لا يوجد أي معدات المختبرات. في منشور سابق، استخدمنا DBS والترصد لاختبار فيتامين (د) وفيتامين (د) البروتين (دبة) في سلسلة من المرضى والقوقاز وأفريقيا9. زملائنا الأفارقة لم تكن قادرة على الحصول على الثلج الجاف. لمقارنة العلامات البيولوجية لفهم الاختلافات في مسار فيتامين (د) بين اثنين من السكان العرقية، علينا مواصلة تحسين الإجراء باستخدام عينات المطابقة المخزنة تحت الظروف القياسية وعلى ورق الترشيح. بعد تحسين الإجراء DBS/DSS، كنا قادرين على تحليل دبة وفيتامين D في مصل المريض في كل الأفواج. ونحن أيضا تقييم عدد من النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) بعد استخراج الحمض النووي من الدم كله للقوقازيين ومن DBS للأفارقة9. ويسمح هذا البروتوكول عينات الدم عالية الجودة ليتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة دون التأثير على أنواع مختلفة من تحليلات المصب تتراوح بين البيولوجيا الجزيئية لفحوصات أليسا. من المستحسن استخدام إدارة المواد البيولوجية في دراسات متعددة المراكز أو المراكز التي لا تملك تسهيلات لظروف التخزين القياسية. ويمثل البروتوكول التالي تتويجا لهذه الإجراءات المحسنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويحقق هذا البروتوكول إمكانية تخزين الدم والمصل على ورق الترشيح عندما لا يكون المعامل على الموظفين أو الهياكل الأساسية اللازمة للتعامل الصحيح مع عينات الدم. على وجه الخصوص، كل الدم أو مصل الدم التي تم جمعها في أنابيب القياسية أو بوخز الإصبع يمكن تخزينها باستخدام هذا الأسلوب، وليس هناك حاج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر تيرني Gráinne للمساعدة التحريرية.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
