3Rs 원리에 비추어 호흡기 모델 동물 연구 대안으로 진화 됩니다. 특히 호흡 물질의 위험 평가 대 한 적절 한 분석의 부족이 이다. 여기, 우리는 공 수 물질의 평가 대 한 인간의 정밀 컷 폐 슬라이스를 사용 하 여를 설명합니다.
그들의 광범위 한 다양성에 호흡기 질병 근본적인 메커니즘을 이해 하 고 새로운 치료제의 개발에 대 한 적절 한 모델 시스템 필요. 또한, 새로운 물질의 등록 다치게 되 고, 예를 들어 작업 환경에서 개인의 위험을 피하기 위해 적절 한 테스트 시스템과 적절 한 위험 평가 해야 합니다. 이러한 위험 평가 동물 연구에서 보통 지휘 된다. 3Rs 원리 및 동물 실험에 대 한 공공 회의론에 비추어 인간 대체 메서드를 정밀 컷 폐 조각 (웹), 진화 되었습니다. 현재 종이 암모늄 hexachloroplatinate (HClPt) 등의 저 분자 무게 물질의 immunomodulatory 잠재력 연구를 인간의 웹의 비보 전 기술을 설명 합니다. 측정 된 끝점 생존 등 지역의 호흡기 염증, cytokines 그리고 발산의 변경된 분 비에 의해 표시. 프로 염증 성 cytokines, 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 그리고 인터 루 킨 1 알파 (IL 1α) HClPt의 하위 독성 농도에 노출 된 후 인간의 웹에서 크게 증가 했다. 웹 기술은 지난 수 십년 동안 실질적으로 최적화 된, 비록 immunomodulation의 테스트에 대 한 그것의 적용은 아직도 개발. 따라서, 여기에 제시 된 결과 예비, 그들은 호흡 연구에 귀중 한 도구로 인간의 웹의 잠재력을 보여 비록.
알레르기 성 천식, 직업 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 위와 더 낮은 기도의 감염 등 호흡기 질병 증가 하 고 전세계 건강 부담1,2를 나타냅니다. 적합 한 테스트 시스템은 적절 한 물질의 개발 뿐만 아니라이 질병을 기본 기본 메커니즘의 일부를 식별 하는 데 필요한. 임상 약물 개발 뿐만 아니라 기본 연구는 생체 외에서 또는 vivo에서 분석 실험에서 얻은 결과에 집중 된다. 그러나이 분석 실험은, 그들의 한계3있다. 첫째, 분석 실험 체 외에 활용 인간의 세포는 고립 되었고 인접 한 조직이 나 장기에서 제거 되며 따라서 더 이상와 상호 작용 하거나 다른 세포3에 의해 보호 될 수 있습니다. 둘째, 동물 모델은 종종 생리 및 생 화 확 적인 차이점4차이로 인해 인 간에 게 번역. 이러한 한계를 최소화는 3Rs의 맥락에서 (, 세련미, 감소) 원칙5, 새로운 대체 모델은 끊임없이 발전 하는.
대체 인간의 3 차원 조직 모델, 웹, 생체 외에서 인간 기반 및 복잡 한 동물 vivo에서 모델 간의 링크는. 웹은 호흡기6에 모든 관련 셀 종류와 기능이 반영합니다. 또한, 웹 기술은 단일 동물 또는 인간 조직 기증자 로부터 정확한 두께의 여러 얇은 조각의 재현할 준비의 이점이 있다. 이 내부 제어 뿐만 아니라 다른 농도 또는 테스트할 마약.
피셔 그 외 여러분 에 의해 1994 년에 인간의 폐 한 가득 조각의 첫 번째 도입 이후 7 조각화 및 폐 조직 배양 기술을 크게 향상 되었습니다. 기독교 마틴 외. 이 기술은 더 화학과 약리학 응용 프로그램8을 개선 했습니다. 우리의 그룹이이 기술은 기독교 마틴에 의해 2007 년에 도입 되었다. 그 이후, 연구에서 웹의 응용 프로그램 기능에 대 한 응답, 기도9,10 , vasoconstriction11, 같은 면역학, 약리학12,13, 테스트에서 확장 했다 그리고 독물학7 여러 실험실에서 다양 한 종에서 테스트. 예를 들어, Schlepütz 외. 14 종의 차이 대 한 기도 응답을 조사 하 고 비교 주변 신경 활성화 전기 필드 자극 (EFS) 또는 capsaicin 쥐, 쥐, 기니 돼지, 양, marmosets, 및 인간. 그들은 신경 중재 기관지의 고유 하지만 다른 패턴을가지고 다양 한 종족을 발견 하 고 일반적으로 사용 되는 실험실 동물 (쥐, 쥐)는 항상 인간의 응답을 반영 하지 않습니다 결론을 내렸다. 폐 독성 테스트와 이러한 맥락에서 헤스 외 동물의 수를 줄이기 위해 15 미리 흡입 독성 연구를 위한 비보 전 대신 쥐 웹 확인. 이 multicentric 사전 검증 연구 결과 유망한 결과 함께 웹을 사용 하 여 두 개의 예측 모델의 개발.
또한, 기초 연구에 웹 칼슘 신호16, 초기 알레르기 성 응답17및 바이러스 감염 응답18,19명료 하 사용 되었습니다. 기술 진보는 지속적인 고 더 진보 탐구 되 고 있다. 예를 들어 필드 저장 및 냉동된 조직의 재사용에 의해 인간의 조직 혜택을 증가 하고있다. 로즈 그 외 여러분 설명 중지 및 재개 능력 기도의 자극에 따라 계약을 유지 하는 murine 웹의 기술: 따라서, 기술은 연장 가능한, 그리고 그래서 더 조직 유지 하는 제한 된 시간 창 분석 실험은 동일한 기증자20시간이 지남에 따라 적용할 수 있습니다. 이러한 연구 발전, Lauenstein 그 외 여러분 뿐만 아니라 21 은 최근 인간의 웹 직업 천식에 대 한 잠재적인 sensitizers 역할을 수 있는 다양 한 화학 물질의 위험 평가 조사.
그 증상은 공기 흐름 방해와 기도 hyperresponsiveness, 유사한 알레르기 성 천식, 직업 천식, 높은-분자-무게 (HMW)22 또는 저 분자 무게 (LMW) 물질23 에 노출에 의해 유도 된다 (예: , 백 금 화합물) 직장 환경에서. LMW 에이전트 haptens 형성 때 잠재적인 높은 민감성을가지고 고 캐리어 단백질21에 바인딩합니다. 새로운 HMW 또는 LMW 화학 물질의 등록 잠재적인 putative 그들의 민감성에 관한 생체 외에서 그리고 vivo에서 위험 평가가 필요한 (예., OECD 가이드라인 429)24. 그러나 잠재적인, 상 상속 민감성을 결정 하는 데 사용 하는 테스트, 원래 설계 되지 않은 호흡기 sensitizers, 위험 평가 하지만 연락처 sensitizers, 물질25의 작은 하위 집합에 대 한 몇 가지 적합성 있을 듯 하지만 . Lauenstein 그 외 여러분 에 의해 작업 putative 접촉 또는 폐 sensitizers21의 위험 평가 대 한 대체 테스트 전략을 개발 하기 위해 센스-그것-4 유럽 연합 프로젝트의 일환으로 설계 되었다. 이 프로젝트를 위해 우리는 대체 테스트 도구로 인간의 웹의 유용성을 테스트에 집중 했다. 따라서, immunomodulatory 끝점 (예를 들어, 생존 및 cytokine 분 비)의 집합 LMW 백 금 화합물 등의 화학 물질의 자극 또는 염증 성 잠재력을 결정 하기 위해 선정 됐다. Lauenstein 외. 모든 호흡기 sensitizers;에 적용할 수 있는 일반적인 패턴을 발견 그러나, 그들의 작품26최근에 출판 된 프로토콜 대 한 기초를 제공합니다.
요약 하면, 준비와 인간의 웹의 후속 노출에 대 한 여기에 제시 된 프로토콜 메서드를 제공 합니다 도움이 잠재적으로 폐 독성의 평가 및 호흡기의 개발에 참여 있을 immunomodulatory 물질 질병, 직업 천식 등입니다.
인간의 웹 기술은 우리의 실험실에서 잘 설립입니다. 현재 종이이 기술과 폐 조직 비보 전물질의 독성 시험에 대 한 사용 설명을 제공 합니다. 일반적으로, 정량 범위 정의 variabilities, 그리고 실험의 타당성을 보장 하는 품질 제어의 추정 관련 모든 실험실을 사용 하 여이 기술을 설정 분석 결과를 받아야 한다. 가능한 표준 절차 수, 예를 들어 각 끝점, 예를 들어, 샘플 등 긍정적인 당 2 ~ 3 기술 복제의 최소 최소 3 명의 생물 학적 기증자 (개별 실행)에서 세포 독성 분석 실험을 반복 하 고 네거티브 참조 합니다. 실험실 인원 분석 결과 일관성을 증가 분석 결과 변화를 최소화 하 고 훈련 한다.
폐 조직에 물질의 immunomodulatory 효과 평가 하기 위해 자주 사용 하는 끝점 포함 세포 독성 측정 (예를 들어, LDH 분석 결과, 서 부 표준시-1 분석 결과, 분석 결과 얼룩이 지기 현미경) 다른 분석 실험을 사용 하 여, cytokine 방출 분석 실험도 식 프로필과 immunohistopathological 방법6세포 인구에 있는 변화의 특성의 변화. 또한, 인간의 웹으로 또한 옮겨질 수 있다 하 고 따라서 전에 세포 구성에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다 murine 웹28 폐 수지상 세포와 같은 셀의 시각화를 설명 하는 기술이 있다 고 후에 상 상속 세포 독성 물질과 치료.
이 기본 프로토콜 및 인간의 폐 조직 단면도의 준비에 대 한 기술 간행물29에 잘 설명 되어 있는 기술을 비교입니다. 즉, 기관 자료 절제술 또는 이식 수술을 받아야 할 폐 암, 등 라이브-위협 하는 만성 질병 으로부터 고통 받는 환자에서 얻은 것입니다. 연구는 지역 윤리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다. 환자 정보 동의서가 필요 합니다. 클리닉 및 연구소 간의 워크플로 설정은 중요 한 문제 이며 통신, 인터페이스 및 두 사이트 간 인프라의 정의. 인간의 폐 재료 조직의 생존을 유지 하기 위해 절제 후 직접 처리할 수 있다. 그것은 젊은이 노인 모두 폐를 건강 하 고 병에 걸리는 폐 인간 웹에 대 한 여기에 설명 된 기술을 적용할 수 있습니다 언급할 가치가 있다. 예를 들어 미국에서 폐를 건강 한 장기 기증자 사고에서 죽은 또는 그 장기 이식에 대 한 거부 되었습니다에서 가능 하다.
프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계는 기도 및 주변 실질 agarose 솔루션의 인플레이션입니다. 이 단계는 후속 조각화 절차에 대 한 매우 부드러운 조직을 공고히 하는 데 필요한. 여기 질병 배경에 따라 인간의 폐 재료의 질이 중요 합니다. 그대로 늑 막에와 함께 엽만 채울 수 있습니다. 기관지 근처 말기 종양은 가끔 작성 프로세스를 방지합니다. 인간의 재료를 팽창 하기 전에 agarose 솔루션의 온도 철저 하 게 검사할 수 있다. 너무 많은 혈액 (또는 다른 체액, exudates) 인간 안에 폐 조직 agarose의 원치 않는 희석 고 중 합 과정에 영향을 미칠 것 이다. 폐 조직의 인플레이션 및 얼음에 agarose의 고, 후 폐 200 ~ 300 µ m 두께의 섹션으로 절단 됩니다. 조직의 일관성은 매우 중요 한 문제입니다. 조직 너무 연약한 경우에, 동일한 섹션의 슬라이스 하는 것은 어렵습니다. 각 폐에 대 한 매개 변수는 각 기증자, 기증자 사이 조각의 두께 다를 수 있습니다에 대 한 설정 되어 동일한 톰, 개별로 조건 및는 팽창 하는 동안 변경 내용을 처리 하는 경우에. 조직의 휘도가 작성 다른 슬라이스 두께에 발생 합니다. 측정 하 고 표준화 하는 조각의 두께, 대신 총 단백질 함량의 측정 폐 슬라이스 두께 직접 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 여러 가지 말기 질병 방해 조각화 프로세스; 예를 들어, 혈액 혈관은 폐 고혈압과 거리 조직에 두꺼워 매우 단단하게 가능 하다 조직 실린더의 조각화와 톰 블레이드 매우 자주 교체 해야 그래서 뻣 뻣 한 수 있습니다.
인간 웹 및 집중 단계 세척의 준비, 후는 세포 파편을 제거 하는 데 필요한 하 고 출시 효소, 조직 실험29의 섹션은 사용할 수 있습니다. 인간의 웹 정상 세포 배양 조건에서 배양 되며 노출 하는, 예를 들어 화학 물질, 약물, 또는 lipopolysaccharides. (알 수 없음된) 감염으로 인해 웹의 가끔 오염 인간 폐 재료의 문화에 특별 한 문제입니다. 감염을 표시 하는 조직 문화를 폐기 해야 하 고 장비를 철저 하 게 소독 해야 합니다. 다른 한편으로 준비를 위해 한 손으로 사용 하는 실험실 장소 및 경작 사이 공간 별거 교차 감염을 피하기 위해 도움이 됩니다. 장비에 관하여는 톰 누설 수 있습니다, 그리고 느슨한 육각 나사 모터 손상 및 블레이드 운동의 중지 발생할 수 있습니다. 슬라이서의 모든 부분 스테인레스 스틸로 만들었고 그래서 그것 건조 하지 경우 산화 됩니다 즉시 청소 변경. 장비 문제를 해결 하려면 적어도 하나의 백업 장치를가지고 필요할 수 있습니다.
이전 간행물에서 agarose 씻 겨 보고 되어과 집중 준비 후 단계를 세척 하는 동안 제거. 사실, 이것은 불가능 하는 agarose를 제거할 수 없습니다. agarose의 완전 한 제거, 조직을 파괴 하는 것을 높은 온도에서 다시 녹 인 될 필요 합니다. 폐 포 및 항공 agarose 설명된 끝점 방해 하지 않습니다. 다른 끝점 agarose의 존재에 의해 영향을 받을 수 있습니다 (제한 참조). 조직 생존 능력은 문화에서 중요 한 문제가 매우 신선한 조직 단면도 준비할 필요가 강조 되어야 했다. 기관지는 생존에 대 한 유효한 매개 변수가 아니다. 적어도 2 개 또는 3 개의 독립적인 세포 독성 분석 실험을 사용 하 여 주변 실질;의 생존 능력을 확인 하는 것이 좋습니다. 이것은 모든 실험30에 체크 합니다. 세포 독성 분석 실험에서 품질 컨트롤 부족 조직 생존 능력의 지표 역할을 합니다. 따라서, 모든 세포 독성 분석 실험에 세제와 같은 효과적인 독성 물질에의 조직, 예를 들어 응답을 평가 하는 것이 좋습니다. 복용량 응답 곡선을 바탕으로, 흡수의 최소 및 최대 값 세포 독성 분석 실험에 대해 정의 하는 데 필요한 하 고 후속 실험을 위해 만났다. 추가 수정 프로토콜에 주로 적용 된 화학 물질과 관심의 끝점에 따라 달라 집니다. 불 용해성 또는 반응성이 매우 높은 화학 물질의 적용은 제한 됩니다. DMSO에 대 한 높은 용 매 농도 1%로 제한 됩니다. 높은 농도 사용할 수 있지만 프로 염증 성 cytokines, IL-8 등의 발음 릴리스에서 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 사용 하는 자극은 상대적으로 약한 수 있습니다. 이 경우에, 조직의 양은 2 잘 당 4 조각에서 늘릴 수 있습니다. 이 방법은 24 시간을 생존 능력을 제한합니다.
인간의 웹의 주요 한계는 독일에서 그들은 준비 될 수 있다 질병 인간 폐 자료에서 이다. 수술을 받을 환자는 일반적으로 50 년 보다 더 오래 된와 폐암에서 고통 받는 환자의 80%는 흡연 자 수 하는 데 사용. 환자, 스테로이드 제제 등의 약물도 인체 조직을 사용 하 여 실험의 결과 좌우할 수 있다. 따라서, 그것을 필수적 이다: i) 긍정적인 참조 생존 능력, 기능, 및 개별 조직의 감도 확인 하 여 각 실험의 유효성을 검사 하 고 ii) 크로스-건강, 비 병에 걸리는, 중간 나이 폐 조직에서를 사용 하 여 결과 확인 실험 동물 (cynomolgus 같은 비 인간 영장류 고, 가능 하면, 마우스, 쥐, 기니 피그). 병에 걸리는 직물의 더 나은 병 리 점수는 더 나은 실험 결과. 주로 병에 걸린 조직을 거의 사용할 수 하 고 매우 자주 쇼 제한 가능성, inadequately 낮거나 매우 높은 cytokine 수준, 세균 이나 곰 팡이 감염, 그리고 적은 기관지. 기증자 기증자 변형 높은 인간의 개별 다양성을 반영 하는 실험실 동물에서 얻은 결과와 비교 됩니다. 그러나 이것은,, 하지 한계 일반적으로; 다른 국가에서 (예를들면, 미국) 그것 죽은 장기 기증자 이식에 대 한 거부에서 건강 한 폐를 얻을 수, 위에서 언급 했 듯이. 조직의 응답 급성 노출 실험에서 48 h에 대 한 첫 번째 최대에 대 한 잘 설명 하고있다. 문화의 많은 일 후에 또는-80 ° c.에 저장 후 생존 및 조직의 기능 감소 약 14 일에 대 한 문화 인간의 폐 조직에 가능 하다. 이 시간 동안 계속 생존 능력 그러나, 다양성, 여러 세포 인구 세포, 조직에서 등의 기능의 손실에 있는 증가 관찰, 제한 된 사이토카인 릴리스 mitogens에 대 한 응답에서 결과. 일부 끝점에 대 한 또 다른 한계는 agarose 방해, 예를 들면, 높은-품질 및 충분 한 양의 RNA31 의 격리 또는 후속 cytometry에 대 한 단일 셀 정지의 준비 조직에 존재 하 고 형질 세포의. 단일 셀 반응과 기능에 기계 통찰력을 얻을 수 있는 가능성은 따라서 제한 됩니다.
Organotypic 조직 모델, 인간의 웹 기본 및 비 임상 연구에 높은 영향을 간주 됩니다. 인간의 폐 재료는 밀접 하 게 정상적인 기관 아키텍처를 반영 하는 생물 학적 구성. 그것은 예를 들어 주거 치경과 기관지 상피 세포, 평활 근 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 섬유, 및 대 식 세포 포함. 조직 실용적 이며 여러 가지 자극에 응답 하는 셀. 비록 섬유, 신경 절단, 활성화 될 수 있다 로컬, 터미널 반사 응답14선도. 따라서,이 비보 전 모델 세포질 타고 난 면역 반응, 방위 응답, 신호, cytokine 유도 세포 표면 마커 연구 가능성을 제공 합니다. 몇 가지 개선 기술, 경작, 및 끝점의 유효성 검사 변환 과학에서 인간의 웹의 사용을 허용합니다. 미래 접근의 예는: i) 유효성 검사의 새로운 대상으로 인간의 폐 조직, 노출, 면역 반응의 평가 ii)에 예를 들어 화학 물질, 약물, 나노 입자, 등, iii), 면역 세포와 폐 조직 보완 등 T-세포, iv)으로 식별 및 호흡기 sensitizers, 질병 유도 물질, 또는 통로; 억제 활성 화합물에 노출 후 분자 패턴 등의 수정 또한, v) 개장 하는 기도 vi) 신경 규정32. 과학 분야는 웹과 현재와 미래의 이러한 접근에 관심을. 또한, 다양 한 다른 개발 cryo 보전20및 조직 호흡 하는 동안 또는 기계적인 직물의 자연 스러운 움직임을 모방 하33 스트레칭 등 웹 기술을 향상 하는 데 도움이 됩니다 있다 환기입니다.
다른 3D 모델에 비해 인간의 웹의 주요 장점은 면역 세포와 신경 섬유의 존재입니다. 실험 또한 마우스, 쥐, 및 아직도 약리학과 독물학에서 가장 자주 사용 되는 동물 종 비 인간 영장류에서 수행할 수 있습니다. 인간의 폐 조직의 복잡성 결과 인간을 동물에서 생체 외에서 vivo에서에서 번역을 지원합니다. 호흡기 sensitizers의 식별에 대 한 기존 대안 분석의 맥락에서 인간의 웹은 매우 복잡 하 고 단일 세포 응답에 대 한 통찰력을 허용 하지 않습니다. 그러나, 현미경 및 흐름 cytometry 바로 세포 마커 사용 하는 경우에, 예를 들어 apoptosis, 괴 사, 또는 세포내 표식 세포질 응답에 대 한 정보를 줄 수도 있습니다. 검증 되 고 호흡기 sensitizers의 식별을 위해 사용 되었다고 보고 있는 게시 된 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 단일 세포 분석 실험을 통해 그들의 모든 장점 가진 웹을 사용 하 여에서 발전 하고있다 귀중 한 기여를 기술은 높은 처리량 검열을 위해 사용 될 수 있다는 의미에서 왓슨 외 에 설명 된 대로 34 그들은 murine cryo 보존 웹에서 기도 독성을 예측 하는 높은 처리량 검열 분석 결과 개발. 그들의 소형된 96 잘 웹 형식으로 그들은 murine 게 액체, 가능한 높은 처리량 분석 결과 웹을 만들기에 유사한 정보를 발견.
The authors have nothing to disclose.
우리는 인간의 웹와 위험 평가 대 한 대체 테스트 전략에 대 한 그녀의 사전 작업에 대 한 Lan Lauenstein를 감사 하 고 싶습니다. 연구의 일부는 6번째 프레임 워크 프로그램 센스-그것-4 “생체 외에서 알레르기 증상의 평가 대 한 새로운 테스트 전략” 내 유럽 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |