Summary

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Abstract

Células B que se ligam aos antígenos de membrana-limite (por exemplo, na superfície de uma célula apresentadora de antígeno) formam uma sinapse imunológica, uma estrutura celular especializada que otimiza a sinalização da B-pilha do receptor (BCR) e aquisição de antígeno BCR-mediada. A remodelação do citoesqueleto de actina e a reorientação da rede microtubule em direcção ao local de contato do antígeno são essenciais para a formação de sinapse imunológica. Remodelação do citoesqueleto de actina, em um anel periférico denso de F-Actina é acompanhada de polarização do centro em direção a sinapse imunológica microtubule-organizadora. Proteínas microtubule plus-final, bem como proteínas cortical plus-final captura mediam interações físicas entre o citoesqueleto de actina e microtúbulos, que lhes permite a ser reorganizado de forma coordenada. Elucidação dos mecanismos que controle Esta reorganização do citoesqueleto, bem como a compreensão de como essas estruturas do citoesqueleto forma formação sinapse imunológica e BCR sinalização, pode fornecer novos insights sobre a ativação de células B. Isto tem sido ajudado pelo desenvolvimento de abordagens de microscopia de super-resolução que revelam novos detalhes de organização da rede do citoesqueleto. Descrevemos aqui um método para usar microscopia de depleção (STED) emissão estimulada simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule GFP-etiquetado transfectadas plus-final nas células B. Para modelar os eventos iniciais na formação de sinapse imunológica, podemos permitir que as células B espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos, que iniciam a remodelação do citoesqueleto e sinalização de BCR. Nós fornecemos protocolos passo a passo para expressar proteínas da fusão de GFP nas células A20 B-linfoma de célula anti Ig-induzida por espalhamento e para fixação da pilha subsequentes, imunocoloração, aquisição de imagem e imagem deconvolução etapas. As imagens de alta resolução obtidas usando estes procedimentos permitem visualizar simultaneamente estruturas de actina, os microtúbulos e as proteínas de ligação plus-final microtubule que podem unir essas duas redes do citoesqueleto.

Introduction

Quando as células B vincular a polarizada matrizes de antígenos (por exemplo, exibido na superfície do antígeno-apresentando células (APCs)), o resultante receptor de células B (BCR) sinalização drives a formação de uma estrutura clássica sinapse imunológica, que foi primeira descrita em T células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, microclusters de antígeno-limite BCRs verbo na periferia da célula B: APC contato local. Estes microclusters, em seguida, mover em direção ao centro do site contato antígeno, onde se fundirem em um cluster de activação supramolecular central (cSMAC) que forma o núcleo da sinapse imunológica. Formação de sinapse imunológica otimiza BCR sinalização e facilita a extração de BCR-mediada do antígeno de membrana APC14. Esta aquisição do antígeno, que é seguida por internalização mediada por BCR antígeno e processamento do antígeno subsequentes, permite que as células B apresentar peptídeo: MHC complexos II para células T e obter ajuda de células T14. Porque a formação de imune sinapse promove a ativação de células B, elucidar os mecanismos que estabelecem que este padrão funcional da organização do receptor pode fornecer novos insights sobre como humorais respostas imunes são iniciadas e regulamentadas.

Reorganização do citoesqueleto de actina e microtúbulos é essencial para a formação de sinapse imunológica. BCR localizada sinalização estimulados por uma matriz espacialmente polarizado de antígenos induz rápida e dramática que remodela o citoesqueleto de actina1,15. A formação de estruturas dendríticas actina na periferia da célula B exerce forças empurra na membrana plasmática e promove a disseminação de células B. Isto permite que a célula B para fazer a varredura de uma área maior da superfície do antígeno-rolamento e aumenta o número de BCRs que ligam o antígeno e ativar BCR vias de sinalização. Ao mesmo tempo, o MTOC e a rede de microtúbulos são reorientados para o local de contato do antígeno. Como o MTOC aproxima-se o local de contato do antígeno, microtúbulos emana o MTOC se estendem ao longo da face interna da membrana plasmática na interface entre a célula B e a superfície do antígeno-rolamento16,17. Estes microtúbulos juxtamembrane podem então agir como faixas para o movimento centrípeto mediada por Dineína de antígeno-limite BCR microclusters18, levando à formação de um cSMAC.

A reorientação e a polarização do MTOC no sentido da sinapse imunológica requer actina intacta e citoesqueleto do microtúbulo e muitas vezes depende de interações entre o actin cortical rede e microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de ligação de actina corticais, como IQGAP1, podem capturar os microtúbulos interagindo com complexos de proteína que decoram o microtubule mais fins-de-21. Estes dinâmicos complexos de proteínas plus-final incluem EB1 e CLIP-170, que são coletivamente referidos como microtubule plus-final rastreamento proteínas (+ dicas)21,22. + Dicas nas extremidades dos microtúbulos podem ligar às proteínas que estão associadas com a membrana plasmática ou o citoesqueleto de actina cortical. Isso permite que os mecanismos de geração de força (por exemplo, o subtração-final dirigido movimento de Dineína corticalmente ancorada ao longo de microtúbulos) exercer forças de tração sobre os microtúbulos, e desse modo reposicionar o MTOC. CLIP-170 pode ligar à proteína associada a actina andaimes IQGAP123, e mostramos que ambos destas proteínas são necessários para a polarização induzida por BCR MTOC em direção a sinapse imunológica17. Essa interação IQGAP1-clipe-170 pode desempenhar um papel fundamental na coordenação a remodelação do citoesqueleto de actina com o reposicionamento da rede microtubule a sinapse imunológica célula B.

Microscopia de fluorescência convencional revelou a reorganização dramática do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a célula B sinapse imune formação2. No entanto, esta abordagem não pode resolver pequenas estruturas celulares em detalhe devido o limite de difração de luz, que, de acordo com a lei do Abbe, depende do comprimento de onda de luz que serve para iluminar a amostra e a abertura do objetiva24. Este limite de difração restringe a resolução dos microscópios de luz convencionais para 200-300 nm no sentido lateral e 500-700 nm na direção axial25. Portanto, menores estruturas subcelulares, bem como os detalhes do citoesqueleto de actina e microtúbulos, poderiam apenas ser observados usando microscopia eletrônica. Imagem de microscopia eletrônica do citoesqueleto é demorada, exige protocolos de fixação e preparação amostra dura que podem alterar estruturas biológicas e é limitado à detecção do anticorpo-negociada. A capacidade de delgados e simultaneamente várias proteínas de imagem ou estruturas celulares é uma vantagem substancial de microscopia de fluorescência. Além disso, expressar proteínas da fusão fluorescente em células permite a geração de imagens em tempo real e é útil quando não existem anticorpos eficazes para immunostaining da proteína de interesse.

Recentes avanços tecnológicos em microscopia de super-resolução superaram os limites de difração de luz e permitiu a visualização de estruturas celulares de nanoescala24. Uma tal técnica de microscopia de super-resolução chama-se microscopia de depleção (STED) emissão estimulada. STED emprega dois lasers, onde um laser excita o fluoróforo e um segundo laser com um padrão em forma de donut seletivamente suprime a emissão de fluorescência em torno do fluoróforo. Isto reduz a função de ponto-propagação (área aparente) de uma única partícula fluorescente e fornece um sub difração limite imagem fluorescente25,26. Microscopia de esgotamento do solo-estado também emprega técnicas baseadas em fluorescência para adquirir imagens de super-resolução. No entanto, os tempos de aquisição e reconstrução de imagem são longos, há apenas um número limitado de fluorophores que pode ser usado, e a imagem de alta resolução simultânea de vários componentes do citoesqueleto é tecnicamente desafiador porque manter estruturas de actina e microtúbulos requer procedimentos de fixação diferentes. Portanto, STED tem várias vantagens sobre microscopia eletrônica e outra microscopia de super-resolução se aproxima em que oferece aquisição de imagem rápida, tem requisitos mínimos de pós-processamento e emprega a mesma fluorophores e técnicas de coloração que são utilizados para microscopia de fluorescência convencional de amostras fixas26.

Microscopia de super-resolução agora tem sido utilizada para visualizar estruturas de actina na sinapse imunológica em assassino naturais (NK) células e T células26,,27,28,29,30, 31. no entanto, imagem de super-resolução de citoesqueleto do microtúbulo, bem como a reorganização coordenada do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a formação da sinapse imunológica, só foi recentemente relatado17. Nós costumávamos microscopia STED células de imagem B que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos que estimulam a BCR sinalização e iniciar a reorganização do citoesqueleto. Quando banhado em imobilizado anticorpos anti-Ig, células B submeter-se dramática dependente de actina se espalhando, que recapitula os eventos iniciais durante a formação da sinapse imunológica. Importante, microscopia STED revelou os detalhes do anel dendrítica de F-Actina que formulários na periferia de imune a sinapse e mostraram que o MTOC, bem como os microtúbulos ligados a ela, havia se mudado perto o antígeno contato local17. Estes microtúbulos estendido para fora para o anel periférico de F-Actina. Além disso, imagens de STED multi cor de várias combinações de F-Actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etiquetado CLIP-170 + dicas mostraram que microtubule mais fins-de-marcados pelo CLIP-170-GFP eram intimamente associados com a malha de actina periférica e com IQGAP1, um proteína de captura cortical17.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o citoesqueleto de actina e microtúbulos na sinapse imune usando microscopia STED de imagem. Esses métodos foram otimizados usando a linha de murino B célula A20, que tem sido amplamente utilizada para estudar a sinalização BCR e sinapse imune formação17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticorpos comerciais para CLIP-170 não funcionou bem para immunostaining em experiências anteriores, descrevemos em detalhe a expressão de GFP-etiquetado CLIP-170 nas células A20, juntamente com protocolos para a visualização em simultâneo de até de coloração três componentes do citoesqueleto ou proteínas de citoesqueleto associadas. Métodos para usando microscopia STED actina imagem em sinapses imunes do NK células têm sido descritos anteriormente40. Aqui, podemos estender esta para aquisição de imagens de resolução super multi cor do citoesqueleto de actina e microtúbulos nas células B.

Uma consideração crítica para microscopia de super-resolução é usando os procedimentos de fixação adequadas para a manutenção de estruturas celulares e prevenção de danos às proteínas fluorescentes. A fixação e coloração métodos aqui apresentados foram otimizados para reter a fluorescência de GFP e fornecer imagens de alta resolução das redes de actina e microtúbulos. Quando expressar proteínas fluorescentes, deve notar-se que as células B são geralmente difíceis de transfect. Usando este protocolo, 20-50% de A20 células geralmente expressam a proteína de fusão de GFP transfectada, e entre esta população, os níveis de expressão da proteína são variáveis. Não obstante, imagem latente de super-resolução de actina e microtúbulos usando os procedimentos que descrevemos é bastante robusto e imagens de alta qualidade são facilmente obtidas. Apesar de seu tamanho pequeno em relação as células A20, mostramos que esses procedimentos também podem ser usados para a rede de microtúbulos na primárias células B que foram ativados brevemente com lipopolissacarídeo (LPS) de imagem. Temos demonstrado que as células B primárias LPS-ativado podem ser transfected com siRNAs com eficiência relativamente alta (ou seja, tal que a depleção de proteína pode ser detectada pelo immunoblotting), tornando-os uma boa alternativa para o uso de linhas de células B para alguns estudos 17.

Protocol

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pela Universidade de British Columbia Animal conta Comité. 1. expressar proteínas GFP-fusão células A20 B-linfoma Células de cultura A20 em completar meio RPMI (RPMI-1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 50 µM 2-Mercaptoetanol, glutamina 2mm, piruvato de 1 mM, 50 penicilina U/mL e 50 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos com 5 % CO2. Pr…

Representative Results

Para as pilhas de B se espalhando em imobilizado anti-Ig, microscopia STED usada em conjunto com software de deconvolução fornece imagens de alta resolução de estruturas do citoesqueleto de microscopia confocal. Isto é evidente na Figura 1, onde a rede de F-Actina foi visualizada usando o protocolo descrito acima. Uma comparação de confocal e imagens de super-resolução STED da mesma amostra mostra que as imagens STED são de resolução mais alta e r…

Discussion

Imagens detalhadas das estruturas do citoesqueleto podem ser obtidas usando microscopia de super-resolução STED, que teoricamente pode alcançar uma resolução de 50 nm, em comparação com microscopia confocal convencional, para os quais a resolução de difração limitada é ~ 200 nm 24. a capacidade de resolver estruturas mais finas é reforçada por usando deconvolução software para calcular a posição mais provável da fonte de luz original do sinal de fluorescência “turva” observados…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Instituto de ciências biomédicas da UBC (LSI) Imaging Facility para apoiar e manter o microscópio STED. Este trabalho foi financiado por grant #68865 dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (M.R.G.). Agradecemos o Dr. Kozo Kaibuchi (Universidade de Nagoya, Nagoya, Japão) para o plasmídeo CLIP-170-GFP.

Materials

Cell culture
A20 mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific  R0883
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 12483020 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M3148
Glutamine Millipore Sigma G5763
Sodium pyruvate Millipore Sigma P5280
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid, 10,000 units
Additional materials for primary B cells
70-µm cell strainer Corning 352350
Magnetic bead-based B cell isolation kit Stemcell Technologies 19854 EasySep Mouse B cell Isolation kit
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L4391 LPS from E. coli 0111:B4
B cell-activating factor (BAFF) R&D Systems 2106-BF-010
Name Company Catalog Number Comments
Transfection
Plasmid encoding CLIP-170-GFP Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended transfection reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Falcon 6-well plates, TC treated, sterile Corning 353046
Name Company Catalog Number Comments
Coating coverslips
18-mm diameter round #1.5 cover glasses Thomas Scientific 1217N81 Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580
Forceps Fisher Scientific 1381242 Dissecting extra fine splinter forceps
Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate Corning 353043
100% methanol Fisher Scientific A412-4
Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Thermo Fisher Scientific 10010049
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-008 For A20 cells
Goat-anti-mouse IgM antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-020 For primary mouse B cells
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Paraformaldehyde (16% stock solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute with PBS to working concentration
Glutaraldehyde (50% stock solution) Millipore Sigma 340855 Dilute with PBS to working concentration
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Saponin Millipore Sigma S2149
Bovine serum albumin (BSA), Fraction V Millipore Sigma 10735094001
Rabbit anti-tubulin antibody Abcam ab52866 1:250 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11009 1:100 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific A12380 1:100 dilution recommneded but should be optimized
Prolong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Without DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Parafilm VWR P1150-2
HEPES Millipore Sigma H3375
NaCl Fisher Scientific BP358
KCl Millipore Sigma P9333
CaCl2 Millipore Sigma C1016
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
MgSO4 Fisher Scientific M63
Dextrose Fisher Scientific D16-500
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscope Leica
Huygens deconvolution software Scientific Voume Imaging See https://svi.nl/HuygensProducts

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Cite This Article
Wang, J. C., Bolger-Munro, M., Gold, M. R. Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57028, doi:10.3791/57028 (2018).

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