Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata
Summary
Vi presentiamo un protocollo per l’utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.
Abstract
Cellule di B che si legano agli antigeni di membrana-limiti (per esempio, sulla superficie di una cellula presentanti l’antigene) formano una sinapsi immuni, una struttura cellulare specializzata che ottimizza la segnalazione della B-cellula recettore (BCR) e acquisizione di antigene BCR-mediata. Il rimodellamento del citoscheletro di actina e il riorientamento della rete dei microtubuli verso il sito di contatto dell’antigene sono essenziali per la formazione della sinapsi immuni. Rimodellamento del citoscheletro in un denso anello periferico di F-actina è accompagnata dalla polarizzazione del centro di organizzazione dei microtubuli verso la sinapsi immune. Proteine leganti plus-fine dei microtubuli, come pure proteine corticale plus-fine acquisizione mediano interazioni fisiche tra il cytoskeletons actina e dei microtubuli, che consentono loro di essere riorganizzata in modo coordinato. Chiarire i meccanismi che questa riorganizzazione del citoscheletro, nonché a comprendere come queste strutture citoscheletriche forma formazione della sinapsi immuni e BCR di segnalazione, di controllo può fornire nuove intuizioni l’attivazione delle cellule B. Ciò è stata facilitata dallo sviluppo di approcci di microscopia di Super-risoluzione che rivelano nuovi dettagli di organizzazione della rete del citoscheletro. Descriviamo qui un metodo per l’utilizzo di microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine transfected GFP-etichettato microtubuli in cellule di B. Per modellare i primi eventi nella formazione della sinapsi immuni, permettiamo a cellule B a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che avviano la segnalazione di BCR e rimodellamento del citoscheletro. Forniamo dettagliate protocolli per esprimere proteine di fusione di GFP in cellule di B-linfoma A20, per la diffusione di anti-Ig-indotta delle cellule e per la fissazione delle cellule successive, Immunostaining, acquisizione di immagini e passaggi di deconvoluzione di immagine. Le immagini ad alta risoluzione ottenute utilizzando queste procedure permettono di visualizzare contemporaneamente l’actina strutture, i microtubuli e proteine obbligatorie plus-fine dei microtubuli che possono collegare queste due reti del citoscheletro.
Introduction
Quando le cellule B associare polarizzati matrici di antigeni (ad es., visualizzato sulla superficie dell’antigene-presentare cellule (APC)), il recettore della B-cellula risultante (BCR) segnalazione unità la formazione di una struttura classica sinapsi immuni, che era prima descritto in T cellule1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inizialmente, microclusters di form di BCRs antigene associato alla periferia del sito contatto B cellulare: APC. Questi microclusters quindi spostare verso il centro del sito contatto antigene, dove si fondono in un cluster centrale attivazione supramolecolari (cSMAC) che costituisce il nucleo della sinapsi immune. Formazione della sinapsi immuni ottimizza la segnalazione di BCR e facilita l’estrazione dell’antigene BCR-mediata dalla membrana APC14. Questa acquisizione di antigene, che è seguita da BCR-mediata antigene internalizzazione e l’elaborazione successiva dell’antigene, permette alle cellule di B di presentare i peptide: MHC II complessi alle cellule di T e suscitare la cellula T Guida14. Perché la formazione della sinapsi immunitaria promuove l’attivazione delle cellule B, chiarire i meccanismi che stabiliscono che questo modello funzionale dell’organizzazione del ricevitore può offrire nuove intuizioni in risposte immunitarie umorali come sono avviate e regolati.
Riorganizzazione dell’actina sia microtubule cytoskeletons è essenziale per la formazione della sinapsi immuni. Segnalazione stimolata da una matrice spazialmente polarizzato degli antigeni localizzati di BCR induce rapida e drammatica rimodellamento del citoscheletro dell’actina1,15. La formazione di strutture dendritiche actina alla periferia della cellula B esercita forze che spinge sulla membrana plasmatica e promuove la diffusione delle cellule di B. Questo permette alla cellula di B di acquisire una maggiore area di superficie del antigene-cuscinetto e aumenta il numero di BCRs che legano l’antigene e attivare vie di segnalazione di BCR. Allo stesso tempo, il MTOC e la rete dei microtubuli sono riorientati verso il sito di contatto dell’antigene. All’approssimarsi del contatto dell’antigene il MTOC, microtubuli che emana dal MTOC si estendono lungo la faccia interna della membrana del plasma all’interfaccia fra la cellula di B e l’antigene-cuscinetto superficie16,17. Questi microtubuli juxtamembrane possono quindi fungere da tracce per il movimento centripeto dineina-mediata di antigene associato BCR microclusters18, portando alla formazione di un cSMAC.
Il riorientamento e la polarizzazione del MTOC verso la sinapsi immunitaria richiede l’actina intatto e cytoskeletons dei microtubuli e spesso dipende dalle interazioni tra l’actina corticale rete e microtubuli16,17, 19,20. Proteine leganti l’actina corticale, come IQGAP1, possono catturare i microtubuli interagendo con complessi proteici che decorano il microtubulo plus-estremità21. Questi dinamici complessi delle proteine leganti plus-fine includono EB1 e CLIP-170, che vengono definiti collettivamente come microtubule plus-fine rilevamento delle proteine (+ puntali)21,22. + Suggerimenti alle estremità dei microtubuli possono associare alle proteine che sono associate con la membrana plasmatica o il citoscheletro di actina corticale. In questo modo i meccanismi di generazione di forza (ad es., il meno-end diretto movimento di dineina corticale ancorata lungo i microtubuli) per esercitare forze di trazione su microtubuli e quindi riposizionare il MTOC. CLIP-170 può legarsi alla proteina actina-collegati ponteggi IQGAP123, e abbiamo dimostrato che entrambi di queste proteine sono necessari per polarizzazione indotta da BCR MTOC verso il sistema immunitario sinapsi17. Questa interazione IQGAP1-CLIP-170 può giocare un ruolo chiave nel coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina con il riposizionamento della rete dei microtubuli alla sinapsi immune della B-cellula.
Microscopia a fluorescenza convenzionale ha rivelato la riorganizzazione drammatica della cytoskeletons actina e dei microtubuli durante la B-cellula immunitaria sinapsi formazione2. Tuttavia, questo approccio non può risolvere piccole strutture cellulari in dettaglio a causa del limite di diffrazione della luce, che, secondo la legge di Abbe, dipende dalla lunghezza d’onda della luce utilizzata per illuminare il campione e l’apertura del obiettivo24. Questo limite di diffrazione vincola la risoluzione dei microscopi ottici convenzionali a 200-300 nm in direzione laterale e 500-700 nm nella direzione assiale25. Di conseguenza, più piccole strutture subcellulari, come pure i dettagli degli cytoskeletons actina e dei microtubuli, potrebbero solo essere osservati usando la microscopia elettronica. Formazione immagine di microscopia elettronica del citoscheletro è che richiede tempo, richiede protocolli fissazione e preparazione del campione duro che possono alterare strutture biologiche ed è limitata alla rilevazione dell’anticorpo-mediata. La capacità di immunostain e contemporaneamente l’immagine più proteine o strutture cellulari è un vantaggio notevole di microscopia di fluorescenza. Inoltre, che esprimono le proteine di fusione fluorescenti in cellule permette l’imaging in tempo reale ed è utile quando gli anticorpi efficaci per immunostaining la proteina di interesse non sono disponibili.
I recenti progressi tecnologici nella microscopia di Super-risoluzione hanno superato i limiti di diffrazione della luce e ha permesso la visualizzazione di nanoscala strutture cellulari24. Una tale tecnica di microscopia di Super-risoluzione viene chiamato emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia. STED impiega due laser, dove un laser eccita il fluoroforo e un secondo laser con un motivo a forma di ciambella selettivamente sopprime l’emissione di fluorescenza intorno il fluoroforo. Questo riduce la funzione di punto di diffusione (zona apparente) di una singola particella fluorescente e fornisce un limite di Sub-diffrazione immagine fluorescente25,26. Microscopia di stato fondamentale svuotamento impiega anche tecniche basate sulla fluorescenza per acquisire immagini di Super-risoluzione. Tuttavia, i tempi di acquisizione e ricostruzione di immagine sono lunghi, ci sono solo un numero limitato di fluorofori che possono essere utilizzato, e l’imaging ad alta risoluzione simultanea di più componenti citoscheletriche è tecnicamente impegnativo, perché mantenere strutture di actina e microtubuli richiede le procedure di fissaggio diversi. Di conseguenza, STED ha più vantaggi rispetto la microscopia elettronica e altre microscopia di Super-risoluzione si avvicina in quanto esso offre acquisizione rapida di immagini, ha i requisiti minimi di post-elaborazione e impiega la stessa fluorofori e tecniche di colorazione che vengono utilizzati per microscopia di fluorescenza convenzionale di campioni fissati26.
Microscopia di Super-risoluzione ora è stata utilizzata per visualizzare le strutture di actina alla sinapsi immune in cellule natural killer (NK) e T cellule26,27,28,29,30, 31. Tuttavia, la formazione immagine di Super-risoluzione del citoscheletro dei microtubuli, così come la riorganizzazione coordinata della cytoskeletons di actina e dei microtubuli durante la formazione della sinapsi immuni, solo recentemente è stato segnalato17. Abbiamo usato la microscopia STED per celle di immagine B che erano state lasciate a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che stimolano la segnalazione di BCR e avviare la riorganizzazione del citoscheletro. Quando placcato sugli anticorpi anti-Ig immobilizzati, le cellule B subiscono drammatica diffusione actina-dipendente, che ricapitola gli eventi iniziali durante la formazione della sinapsi immuni. D’importanza, microscopia STED ha rivelato i dettagli dell’anello dendritica di F-actina che forme alla periferia del sistema immunitario sinapsi e ha mostrato che il MTOC, come pure i microtubuli collegati ad esso, avevano spostato vicino l’antigene contatto sito17. Questi microtubuli esteso verso l’esterno verso l’anello periferico di F-actina. Inoltre, formazione immagine di STED multi-colore di varie combinazioni di F-actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etichettato CLIP-170 + suggerimenti ha indicato che microtubule plus-estremità segnata da CLIP-170-GFP erano strettamente associata con il reticolo di actina periferici e con IQGAP1, un corticale cattura proteina17.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l’actina e microtubule cytoskeletons alla sinapsi immune usando la microscopia STED di imaging. Questi metodi sono stati ottimizzati utilizzando la linea A20 murino delle cellule di B, che è stato ampiamente impiegata per lo studio della segnalazione di BCR e immuni sinapsi formazione17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. perché gli anticorpi commerciali a CLIP-170 non hanno funzionato bene per immunostaining in precedenti esperimenti, descriviamo dettagliatamente l’espressione della GFP-etichettato CLIP-170 in cellule A20, con macchiatura dei protocolli per visualizzare contemporaneamente fino a tre componenti del citoscheletro o proteine associate al citoscheletro. Metodi per l’utilizzo di microscopia STED all’actina di immagine a livello delle sinapsi immune delle cellule NK sono stati descritti in precedenza40. Qui, estendiamo questo per l’acquisizione di immagini ad alta super-risoluzione multi-colore di actina sia microtubule cytoskeletons in cellule di B.
Una considerazione critica per microscopia di Super-risoluzione è utilizzando le procedure di fissazione appropriato per il mantenimento di strutture cellulari e prevenendo danni to le proteine fluorescenti. La fissazione e la macchiatura metodi presentati qui sono stati ottimizzati per conservare la fluorescenza di GFP e fornire imaging ad alta risoluzione delle reti di actina e dei microtubuli. Quando è necessario esprimere proteine fluorescenti, dovrebbe essere notato che le cellule B sono solitamente difficili a transfect. Usando questo protocollo, 20-50% di A20 cellule tipicamente esprimono la proteina di fusione GFP transfettata, e fra questa popolazione i livelli di espressione della proteina sono variabili. Tuttavia, super-resolution imaging di actina e i microtubuli utilizzando le procedure che descriviamo è abbastanza robusta e immagini di alta qualità sono facilmente ottenute. Nonostante le piccole dimensioni rispetto a cellule A20, mostriamo che queste procedure utilizzabile anche all’immagine della rete dei microtubuli in cellule primarie di B che sono stati attivati brevemente con il lipopolysaccharide (LPS). Abbiamo dimostrato che cellule di B primarie LPS-attivato possono trasfettate con siRNA a relativamente alta efficienza (cioè, tale che lo svuotamento della proteina può essere rilevato dall’immunoblotting), che li rende una buona alternativa all’uso di linee di cellule di B per alcuni studi 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immagini dettagliate di strutture citoscheletriche possono essere ottenuti usando la microscopia STED super-risoluzione, che teoricamente può raggiungere una risoluzione di 50 nm, rispetto al convenzionale microscopia confocale, per cui la risoluzione di diffrazione limitata è ~ 200 nm 24. la capacità di risolvere strutture più fini è ulteriormente migliorata utilizzando software di deconvoluzione per calcolare la posizione più probabile della sorgente luminosa originale dal segnale di fluor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la struttura di Imaging di UBC Life Sciences Institute (LSI) per sostenere e mantenere il microscopio STED. Questo lavoro è stato finanziato da grant #68865 l’istituti canadesi di ricerca sanitaria (a M.R.G.). Ringraziamo il dottor Kozo Kaibuchi (Università di Nagoya, Nagoya, Giappone) per il plasmide CLIP-170-GFP.
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
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