קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.
Abstract
המעגל קוצב לב היממה האחראית פלטי פיזיולוגיים ורגשיים קצבית מתואמת עם רמזים סביבתיים, כגון מחזורי יום/לילה. השעון המולקולרי בתוך כל נוירון קוצב לב יוצר השעון הביולוגי בביטוי גנים, אשר מושתתות הפונקציות עצביים קצבית חיוני לפעולה של המעגל. חקירת המאפיינים של הפרט מולקולרית של מחלקות שונות של קוצב לב נוירונים ודן האינטראקציה שלהם עם אותות עצביים התשואות הבנה טובה יותר של המעגל היממה קוצב לב. כאן, אנו מציגים בגישה מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות פותח על מנת לנטר את שעון מולקולרי בנוירונים שעון מהמוח זחל דרוזופילה בתרבית. שיטה זו מאפשרת הקלטת הנמשך של חמשת המקצבים של מקודדים גנטית עיתונאים היממה פלורסנט ברזולוציה תא בודד. תוכנית התקנה זו יכול להיות משולב עם מניפולציות תרופתי לנתח באופן הדוק תגובה בזמן אמת של השעון המולקולרי תרכובות שונות. מעבר מקצבים השעון הביולוגי, שיטה זו תכליתי בשילוב עם טכניקות עוצמתיות דרוזופילה גנטי מציעה את האפשרות ללמוד מגוון תהליכים עצביים או המולקולריות ברקמת המוח בשידור חי.
Introduction
שעונים היממה לעזור אורגניזמים להסתגל לשינויים סביבתיים תקופתיים שנוצר על ידי 24 שעות הסיבוב של כדור הארץ. לולאות משוב תעתיק translational בזו ביסוד נפוץ המנגנון המולקולרי של היממה שעונים על פני מינים1. המעגל היממה קוצב הלב מורכב המכיל שעון נוירונים משלב זמן-של-יום המידע הנמסר על ידי רמזים סביבתיים, כגון/כהה (LD) ומחזורי טמפרטורה, שיתכנן את מקצבי שפע של יומי פיזיולוגיים, תהליכים התנהגותיים2,3. התיאום של מקצבים מולקולרית עם עצביים התשומות והתפוקות חשובה קריטית עבור הפעולה של מעגל היממה אך שרידים הבין באופן חלקי בלבד.
דרוזופילה, בליבה של השעון המולקולרי, heterodimer מחזור/שעון (CLK/CYC) מפעיל שעתוק של התקופה (לאדם), נצחית (tim). לכל וטים יוצרים קומפלקס והזן את הגרעין, שבו הם לעכב פעילות גנים ברמת השעתוק של CLK/CYC וכתוצאה מכך שעתוק משלהם. Post-transcriptional ו- post-translational לגרום לעיכובים שעתוק CLK/CYC-מתווכת בין דיכוי על ידי לכל / טים, המבטיח את הדור של בערך 24 שעות ביממה תנודות מולקולרית1,3,4 . נוירונים כ-150 המכיל טופס אלה שעונים מולקולרית מעגל הבקרה להתנהגות היממה של מבוגר טסה5. כמה פשוטים אך פונקציונליים לחלוטין היממה מעגל חשמלי המורכב 3 קבוצות של נוירונים שעון – 5 נוירונים לרוחב הגחון (LNvs; 4 LNvs PDF-חיובי, LNv PDF-שלילי אחד, ראה להלן), 2 1s נוירון הגבי (DN1s) ו- 2 2s נוירון הגבי (DN2s) – נמצא הזחל המוח6,7.
המעגל פשוט היממה זחל מציע מודל מצויין ללמוד את האינטראקציות בין תקשורת בין-עצביים של שעון מולקולרי. באמצעות הכתבת פלורסנט פיתח לכל-TDT, אשר מחקה את הרמות לכל חלבון ומיקומו subcellular, חיפשנו לאפיין את הדינמיקה של המכני מולקולרית ב שעון שונות תת-קבוצות נוירון במעגל היממה זחל 8. יתר על כן, לדעת תפקיד מפתח של neuropeptide פיזור פיגמנט הגורם (PDF) המיוצר על ידי LNvs 4 בוויסות מקצבים השעון הביולוגי-ברמה העצבית9,10,11, רצינו לבדוק הישירות השפעת PDF על השעונים מולקולרית. לשם כך, פיתחנו שיטה כדי לפקח על ביטוי גנים היממה מקצבים במוח זחל explant על פני ימים מרובים על-ידי קונפוקלית זמן לשגות. הפרוטוקול הותאמה גם עבור מבחני תרופתי לבחון את ההשפעה של PDF או תרכובות אחרות ברמה של פי-TDT. לפיכך, ההסתגלות מורכב לנגישים התרבות explant המוח ליישום סמים, הגדלת רזולוציה טמפורלית, הדמיה עבור משך קצר יותר.
Ex-vivo תרבות של דרוזופילה מוחותיהם של שלבים התפתחותיים שונים היו שנקבעו קודם12,13,14,15,16,17 ,18. והואיל פרוטוקולים אלה שימשו הדמיה תופעות ביולוגיות שונות, חלקם אינם תואמים דימות ברזולוציה תא בודד או אינם תומכים התרבות יותר מאשר מספר שעות. שיטות אלטרנטיביות לביצוע הדמיה חיים לטווח ארוך של היממה נוירונים בדרוזופילה כוללים ביולומינסנציה הדמיה מולקולרית מקצבים19,20,21 קרינה פלואורסצנטית הדמיה של מחוון סידן עם22,של מיקרוסקופ אור גיליון23. למרות ביולומינסנציה הדמיה ניתן להשיג רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להתאמה עבור הדמיה ויוו , הם מוגבלים על הרזולוציה המרחבית, דורשים מערכות מיקרוסקופים מיוחדים.
השיטה המתוארת כאן המותאמים באופן חזותי אותות פלואורסצנט בתרבות כל המוח ברזולוציה תא בודד על פני ימים מרובים. שיטה זו נתיישב ופסיביות יכול להיות מותאם כדי התמונה תרבותי המוח לטוס למבוגרים ו לניסויים תרופתי ללמוד הרבה בעיות שונות מצאו דרוזופילה .
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו תיאר את שיטת עבור קרינה פלואורסצנטית לטווח ארוך זמן לשגות מיקרוסקופ של המוח זחל בתרבית. ההצלחה של ניסויים מסוג זה תלויה גורמים רבים, כגון הבריאות של התרבות, שיטת הנייח של המוח explant, עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחס אות לרעש של הכתב, הזמני, רזולוציה מרחבית, ו נגישות explant. גורמים אלה יכול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מייקל Rosbash על ההדרכה שלו ותמיכה במהלך השלב הראשוני של ההתפתחות של שיטה זו. עבודה זו מומן על-ידי JST פרסטו התוכנית, שוויצרי הקרן הלאומית למדע (31003A_149893 ו- 31003A_169548), המועצה האירופית למחקר (ERC-StG-311194), נוברטיס קרן מחקר ביו-רפואי (13A39), באוניברסיטת ג’נבה .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 – Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O’Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
