Summary

Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Published: January 19, 2018
doi:

Summary

Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.

Abstract

Le circuit de pacemaker circadien orchestre rythmiques sorties comportementales et physiologiques, en coordination avec les signaux environnementaux, tels que les cycles jour/nuit. L’horloge moléculaire au sein de chaque neurone stimulateur génère les rythmes circadiens dans l’expression des gènes, qui sous-tendent les fonctions neuronales rythmiques essentielles au fonctionnement du circuit. Étude des propriétés des oscillateurs moléculaires individuelles dans les différentes sous-classes de neurones pacemaker et leur interaction avec la signalisation neuronale permet de mieux comprendre le circuit de pacemaker circadien. Ici, nous présentons une approche de Time-lapse microscopie fluorescente mis au point pour surveiller l’horloge moléculaire dans les neurones d’horloge de cultivées cerveau larve de drosophile . Cette méthode permet l’enregistrement de plusieurs jour des rythmes de reporters circadiennes fluorescents génétiquement encodées à cellule unique résolution. Cette configuration peut être associée à des manipulations pharmacologiques pour analyser attentivement la réponse en temps réel de l’horloge moléculaire de composés. Au-delà des rythmes circadiens, cette méthode polyvalente en combinaison avec les techniques génétiques puissantes Drosophila offre la possibilité d’étudier différents processus neurones ou moléculaires dans le tissu cérébral direct.

Introduction

Horloges circadiennes aident les organismes à s’adapter aux changements environnementaux périodiques générées par la rotation de 24h de la terre. Les boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel contrefil communément sous-tendent la machinerie moléculaire des horloges circadiennes ensemble espèce1. Le circuit de pacemaker circadien composé horloge contenant des neurones intègre time-of-day information véhiculée par les signaux environnementaux, tels que la lumière/obscurité (LD) et les cycles de température, d’orchestrer les rythmes d’une pléthore de quotidien physiologique et les processus comportementaux2,3. La coordination des rythmes moléculaires avec neuronales entrées et sorties est cruciale pour le fonctionnement du circuit circadien, mais reste que partiellement compris.

Chez la drosophile, au cœur de l’horloge moléculaire, l’hétérodimère/CYCLE d’horloge (CLK/CYC) active la transcription de la période (par) et intemporels (tim). PER et TIM forment un complexe et entrer dans le noyau, où ils inhibent l’activité transcriptionnelle de CLK/CYC et, par conséquent, leur propre transcription. Règlement post-transcriptionnelle et post-traductionnelles entraînent des retards entre CLK/CYC-mediated transcription et de la répression par p. / TIM, assurer la génération de circa oscillations moléculaires 24 h1,3,4 . Environ 150 neurones contenant ces horloges moléculaires forme un circuit de contrôle circadien comportement d’adulte vole5. Un beaucoup plus simple et entièrement fonctionnelles circadiens circuit composé de 3 groupes de neurones de l’horloge – 5 neurones latérale ventrale (LNvs ; 4 LNvs PDF-positif et un négatif PDF LNv, voir ci-dessous), 2 dorsales neurone 1 s (DN1s) et 2 dorsales neurone 2 s (DN2s) – est présent dans les larves cerveau6,7.

Le circuit circadien larvaire simple offre un excellent modèle pour étudier les interactions entre la communication inter neuronale et l’horloge moléculaire. À l’aide de notre reporter fluorescent nouvellement mis au point par-TDT, qui imite les niveaux de protéine et sa localisation subcellulaire, nous avons cherché à caractériser la dynamique de la mécanique moléculaire en sous-groupes de neurone horloge différentes dans le circuit circadien larvaire 8. en outre, connaissant le rôle essentiel du facteur de dispersion de pigment neuropeptide (PDF) produit par 4 LNvs dans la régulation des rythmes circadiens au niveau neuronal9,10,11, nous avons voulu examiner le direct effet de PDF sur les horloges moléculaires. À cette fin, nous avons développé une méthode pour contrôler l’expression des gènes circadiens rythmes dans cerveau larvaire explant sur plusieurs jours en Time-lapse microscopie confocale. Le protocole a été également adapté pour les essais pharmacologiques tester l’effet de PDF ou d’autres composés sur le niveau de p.-TDT. Ainsi, l’adaptation se compose de vulgariser la culture d’explants de cerveau à la demande de drogue, d’augmenter la résolution temporelle et d’imagerie pour une durée plus courte.

Ex vivo culture de Drosophila cerveau des différentes étapes du développement ont été établies auparavant12,13,14,15,16,17 ,,18. Considérant que ces protocoles ont été utilisés pour l’imagerie des différents phénomènes biologiques, certains d’entre eux ne sont pas compatibles avec la formation image à résolution unicellulaire ou ne supportent pas la culture pendant plus de quelques heures. Des méthodes alternatives pour effectuer une imagerie live à long terme des neurones circadiennes chez la drosophile incluent l’imagerie bioluminescence des rythmes moléculaires19,20,21 et imagerie de fluorescence de indicateur de calcium avec nappe de lumière microscopie22,23. Bien que l’imagerie de bioluminescence peut atteindre une résolution temporelle plus élevée et la microscopie de nappe de lumière peut être adaptable pour l’imagerie in vivo , ils sont limités à la résolution spatiale et exigent des systèmes spécialisés de microscope.

La méthode décrite ici est adaptée pour visualiser les signaux fluorescents dans la culture de cerveau entier à cellule unique résolution sur plusieurs jours. Cette méthode facile et polyvalente pourrait être adaptée à cervelle de mouche adulte image cultivée et d’expériences pharmacologiques d’étudier de nombreux problèmes différents en neurobiologie de la drosophile .

Protocol

1. préparation des Solutions mères sous une hotte de Culture Préparer 400 mL 1 x milieu actif Schneider (SAM) optimisé pour ex vivo culture des larves cerveaux (modifié d’après référence24,25) (tableau 1). Aliquote de 5 mL et flash congélation dans l’azote liquide (LN2), conserver à – 80 ° C. Préparer 1 x disséquant une Solution Saline (DSS) en diluant 10 x solution mère (adapté de réfé…

Representative Results

Nous démontrons ici les résultats représentatifs de l’enregistrement à long terme d’un reporter fluorescent circadiens dans ex vivo la culture larvaire de cerveau et les résultats d’imagerie en live d’application bain PDF sur l’expression du Rapporteur. Les larves L3 non-errance exprimant la journaliste horloge moléculaire p.-TDT et SAMU-mCD8::YFP conduite par un chauffeur de neurone horloge Clk 856-…

Discussion

Ici, nous avons décrit la méthode pour à long terme fluorecence Time-lapse d’élevage larvaire cerveaux. Le succès de ce type d’expériences dépend de plusieurs facteurs, tels que la santé de la culture, procédé d’immobilisation de l’explant de cerveau, l’intensité de la fluorescence et la ratio signal-bruit de la journaliste, temporelle et la résolution spatiale, et accessibilité de l’explant. Ces facteurs peuvent s’exclure mutuellement. Par exemple, augmentation de fréquence de Time-lapse affe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Michael Rosbash son mentorat et soutien durant la phase initiale du développement de cette méthode. Ce travail a été financé par le programme JST PRESTO, de la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 et 31003A_169548), l’European Research Council (ERC-StG-311194), la Fondation Novartis pour la recherche médicale-biomédicale (13A39) et l’Université de Genève .

Materials

KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
NaCl Sigma-Aldrich S5886
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1000
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
BIS-TRIS Sigma-Aldrich B4429
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T0167
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512
Fumaric acid Sigma-Aldrich F8509
α-Ketoglutaric acid Sigma-Aldrich K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened BioConcept Ltd. Amimed 2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-654011
KCl Sigma-Aldrich P5405
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S5011
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Fibrinogen from bovine plasma Calbiochem (Merck) 341573-1GM CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasma Sigma-Aldrich T9549 CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH Chi Scientific custom made
Vaccum grease Sigma-Aldrich 18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes fisherscientific 08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm Millipore SCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) film Dupont 200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore SLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore SLGV033RS
Three-well glass dissection dish Any company
Fine forceps, size 5, Dumont Fine Science Tools 11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors Leica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamber Life Imaging Services The CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controller Life Imaging Services custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin ImageJ software
10x iterative deconvolution AutoQuant and Imaris software

References

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Cite This Article
Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. J. Vis. Exp. (131), e57015, doi:10.3791/57015 (2018).

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