通过流式细胞术, 我们勾勒出一种检测白血病干细胞标记物同时表达的协议。我们展示了如何量化三个祖群体和一个假定的多项种群的成熟程度。我们证实了这些人群存在于相应的病人衍生的移植。
急性髓系白血病 (AML) 是一种异种, 如果不治疗, 致命的疾病。这是成人白血病相关死亡的最常见原因。首先, AML 是一种造血干细胞 (HSC) 的疾病, 其特点是: 停止分化, 随后聚集白血病爆炸细胞, 减少功能性造血元件的生产。异质性延伸到白血病干细胞的存在, 这一动态细胞室的演变, 以克服各种选择压力强加在白血病的进展和治疗。为了进一步定义非定常种群, 添加 CD90 和 CD45RA 允许在 CD34+CD38 细胞间区分正常的 HSCs 和多能祖。在这里, 我们概述了一个协议, 以检测几个假定的 CD34, CD38, CD45RA, CD90) 的人反洗钱的主要爆炸细胞, 多参数流式细胞术的同时表达。此外, 我们还展示了如何量化三个祖群体和一个假定的多项种群的成熟程度。我们证实了这些人群存在于相应的病人衍生的移植。这种检测方法和定量的假定的可用于临床随访的化疗反应 (i. e., 最小残留疾病), 因为残端细胞可能导致 AML 复发。
急性髓系白血病 (AML) 是导致白血病相关死亡的最常见原因。首先, AML 是一种造血干细胞 (HSC) 的克隆病, 其特点是: 停止分化, 随后累积爆炸细胞, 减少功能性造血元件的生产。近年来, 通过使用下一代测序策略和显示肿瘤细胞内克隆进化的存在性, 建立了爆炸细胞种群的无性系异质性, 并表明其存在于1。
异质性延伸到白血病干细胞的存在。据推测, 这种动态细胞室的演变, 以克服各种选择压力强加在白血病的进展和治疗。因此, 对目前的化疗方案和介导的疾病复发有抵抗力, 其临床意义2。各种标记都被描述为特征 CD1233、CLL-14、CD975或 TIM-36等。CD34+CD38 的爆破细胞的隔室被认为是丰富的, 为7 , 但也包括正常的 HSC。CD90 和 CD45RA 表达式应用于 CD34+CD38 (P6) 隔间 (图 1) 允许隔离正常和恶性造血前体的几个阶段8。具体地说, 正常的 CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs, 多能祖 (MPP) 像 CD34+CD38-CD90dimCD45RA 细胞和 CD34+CD38-CD90-CD45RA+ 淋巴引物多能祖 (LMPP) 细胞可以确定在大多数 AML 病例中,8 ,9。CD38 的平均荧光强度 (多边基金会) 在 CD34+ 细胞室中尤为重要。因为 CD38 强度定义了三个新的细胞间隔: CD38 阴性 (P6), CD38 暗淡 (P7) 和 CD38 明亮 (P8) (图 1)。CD38 可以通过 hematogones 和/或血浆细胞作为内部阳性控制来确定, 因为这些细胞强烈表达 CD38。
immunodeficient NOD/SCID/IL2Rγcnull (核供应集团) 鼠标模型广泛用于植入正常和恶性人类造血细胞10,11。采用系列异种移植方法对功能进行实验验证。通过大规模测序方法对这些研究进行了广泛的分析。然而, 与其主要的 aml (图 2) 相比, 反洗钱爆炸种群的嫁接和 HSC 免疫表型对核供应的小鼠的认识较少。
该方法的数量在本质上是低的, 因此, 识别和量化的研究是有挑战性的, 这里描述的方式可以作为一个流细胞分析诊断和临床随访评估化疗反应 (作为残留的可能引起 AML 复发)。存在的可显示阳性的最小残留疾病 (MRD)。迄今为止, 在反洗钱中的 MRD 监测主要依靠分子方法 (即, rt-pcr,)10,12。然而, 在本协议中, 我们通过多参数流式细胞术 2, 8 9, 在人类反洗钱的主要爆炸细胞中检测出几种 HSC/CD34 标记 (CD38、CD45RA、CD90) 的同时蛋白表达.这种抗体组合可应用于任何标准流式细胞仪实验室, 这种流动的 mrd 检测特别有趣, 当 MRD 的实时聚合酶链反应 (RT PCR) 是不可能的,即, 如果白血病特异分子标记在诊断 AML 样本中无法检测到。此外, 本议定书补充了更为敏感的分子 MRD 技术, 因为它旨在检测和量化代表功能细胞特征的异常造血祖细胞 (图 3)。
我们展示了如何用流式细胞术来量化三个造血祖群和不同成熟度的可供选择的隔间室, 而大多数临床实验室都有抗体。此外, 我们证实了这些细胞室在相应的病人派生移植 (PDX) 和治疗随访。
通过流式细胞术对膜或细胞质标记进行准确和可重复的评估, 要求仪器设置每天都要经过验证, 以进行光学对准、射流系统的正常运行、光学灵敏度和标准化使用校准珠。
应用多参数流式细胞仪分析 CD90 和 CD45RA 检测 AML 中的爆炸细胞群是一种比较简单可靠的方法。这项分析的一个关键步骤是准确评估 CD38 在爆炸细胞中的表达, 以便正确地进行 CD34+CD38 的门控。CD38 强度的定义是…
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分是由法国协会 Laurette Fugain、LigueContre 乐癌症 (北中心)、法国基金会 (白血病委员会)、SIRIC Oncolille 和法国国家癌症研究所支持的。
Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |