Summary

Изготовления поверхностей оптическое качество стекла для изучения макрофагов Fusion

Published: March 14, 2018
doi:

Summary

Этот протокол описывает изготовление оптического качества стеклянных поверхностей, адсорбированного с соединениями, содержащими длинноцепочечных углеводородов, которые могут использоваться для мониторинга макрофагов слияние живых образцов и позволяет суперразрешением микроскопии фиксированной образцов .

Abstract

Визуализация формирования многоядерные гигантские клетки (MGC) от живых образцов была сложной тем, что наиболее живой тепловизионные методы требуют распространения света через стекло, но на стекле макрофагов fusion-это редкое событие. Этот протокол представляет изготовление нескольких поверхностей оптическое качество стекла, где адсорбции соединений, содержащих длинные цепочки углеводородов превращает стекла в fusogenic поверхность. Во-первых описана подготовка поверхностей чистого стекла как исходный материал для модификации поверхности. Во-вторых метод предоставляется для адсорбции соединений, содержащих длинные цепочки углеводородов для преобразования не fusogenic стекло в подложке fusogenic. В-третьих этот протокол описывает изготовление поверхности micropatterns, которые способствуют высокой степенью пространственно-временных контроля над MGC формирования. Наконец изготовлении стекла дно блюда описан. Приведены примеры использования этой системы в vitro клетки в качестве модели для изучения фьюжн макрофагов и MGC формирования.

Introduction

Формирование MGC сопровождает ряд патологических состояний в организме человека отличаются хроническим воспалением1. Несмотря на соглашение, что макрофаги mononucleated предохранитель в форме MGC2, удивительно мало исследования показали фьюжн в контексте с живых образцов3,4. Это потому, что чистый стеклянных поверхностей, которые требуются для большинства методы визуализации не способствуют макрофагов фьюжн когда индуцированных воспалительных цитокинов5. Действительно если чистое стекло используется как субстрат для fusion макрофагов, затем низкого до среднего масштаба цели (т.е., X 10-20) и более чем 15 h непрерывного изображений часто требуется соблюдение одного сплавливание событие.

С другой стороны, fusogenic пластиковых поверхностей (например, permanox) или бактериологического пластика содействовать сплавливание2. Однако изображений через пластиковые проблематично, потому что подложки толщиной и рассеивает свет. Это осложняет, воображения, поскольку давно рабочих расстояние (LWD) целей требуются. Однако LWD целей обычно имеют низкой освещенности сбора потенциал, по сравнению с их coverslip исправлены коллегой. Кроме того методы, которые используют изменения полярности света, проходящего через образец как дифференциальной помехи контраст невозможно, поскольку пластик двулучепреломление. Барьеры, связанные с использованием пластиковых далее подчеркнули тот факт, что невозможно предсказать, где будет происходить макрофагов фьюжн/MGC формирование на поверхности. Вместе, эти ограничения ограничивают визуализации макрофагов сплавливание к фазе контраст Оптика, расширенный общей длительности визуализации (> 15 часов непрерывной) и низкого разрешения.

Недавно мы определили сильно fusogenic поверхности стекла во время проведения одной молекулы супер резолюции микроскопии с фиксированными макрофагов/MGC4. Это наблюдение было удивительно, потому что чистое стекло поверхности содействовать Фьюжн по очень низкой ставке ~ 5% после 24 часов в присутствии интерлейкина-4 (Ил-4) определяется сплавливание индекса4. Мы обнаружили, что способность содействовать сплавливание было обусловлено Олеамид загрязнения. Адсорбция Олеамид или других соединений, которые аналогичным образом содержатся углеводороды длинноцепочечных сделал fusogenic стекла. Большинство fusogenic соединения (парафин) был micropatterned, и он передал высокую степень пространственно-временных контроля над fusion макрофагов и 2 раза увеличение числа событий фьюжн, наблюдаемыми в такое же количество времени, по сравнению с permanox. Эти оптические качества поверхности представила первый проблеск в морфологические особенности и кинетики, которые регулируют формирования MGC в живых образцов.

В этом протоколе мы описываем изготовление различных стеклянных поверхностей, которые могут использоваться для мониторинга образования MGC из живых образцов. Кроме того мы показываем, что эти поверхности поддаются дальнего поля суперразрешением методов. Поверхности изготовление зависит от цели эксперимента, и каждая поверхность описан с соответствующих примеров в тексте разбирательства.

Protocol

Процедуры, которые используют животных были утверждены животное уход и использование комитетами в клинике Майо, Janelia исследований университета и университета штата Аризона. 1. Подготовка кислоты чистить Стекло покровное Примечание: крышка стекла, приобрет…

Representative Results

Физико-химических параметров материалов иметь драматический влияние на степень макрофагов фьюжн7,8,9,10. Кроме того поверхностные загрязнители известны содействовать макрофагов фьюжн11….

Discussion

Необходимость выявления и впоследствии разработать оптическое качество стеклянных поверхностей, которые способствуют макрофагов фьюжн вытекает из того факта, что пока не недавно опубликованное исследование, непосредственно визуализировать фьюжн макрофагов в контексте жизни образ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить членов Ugarova лаборатории и следователей в центре метаболических и сосудистая биология за полезные обсуждения этой работы. Джеймс Фауст хочет выразить свою благодарность инструкторы на курс Европейской лаборатории молекулярной биологии супер резолюции микроскопии в 2015 году. Мы хотели бы поблагодарить Сатья Khuon Janelia за помощь с Пробоподготовка для LLSM. В ходе обзора и съемок части этой работы Джеймс Фауст был поддержан T32 стипендий (5T32DK007569-28). Решетка свет лист компонент этой работы была поддержана HHMI и Гордон Мур фонд и Бетти. Т.ю. финансируется NIH Грант HL63199.

Materials

Plasma cleaner Harrick Plasma PCD-32G
Finder grid Electron microscopy sciences G400F1-Au any gold TEM grid will work
Cover glass (22×22 mm) Thor Labs CG15CH use only high stringency cover glass
Paraffin wax Sigma Aldrich 17310
Petrolatum Sigma Aldrich 16415 must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide Sigma Aldrich O2136 prepare fresh
Isopropanol Sigma Aldrich 278475
Toluene Sigma Aldrich 244511
Acetone VWR International BDH1101
Ethanol Electron microscopy sciences 15050 use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid Fischer Scientific A144C-212 use to acid wash cover glass
Slyguard 184 VWR International 102092-312 mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish Santa Cruz Biotech sc-351864
Dumont no. 5 forceps Electron microscopy sciences 72705 ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS Atlanta Biological S11550
DMEM:F12 Corning 10-092 contains 15 mM HEPES
Pen/Strept Corning 30-002-Cl
HBSS Corning 21-023
BSA solution Sigma Aldrich A9576 use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4 Genscript Z02996 aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J Jackson Laboratory 000664 use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice n/a n/a use for live fluorescence imaging
Kimwipe Kimberly Clark  34155 use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces

References

  1. McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
  2. Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
  3. Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
  4. Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
  5. Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
  6. Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
  7. Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
  8. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
  9. Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
  10. DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
  11. Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
  12. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  13. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  14. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  15. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  16. Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
  17. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  18. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
  19. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
  20. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
  21. Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).

Play Video

Cite This Article
Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Heddleston, J., Chew, T., Lampe, M., Balabiyev, A., Ros, R., Ugarova, T. P. Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion. J. Vis. Exp. (133), e56866, doi:10.3791/56866 (2018).

View Video