Summary

Fabrication de Surfaces de verre de qualité optique pour étudier la Fusion des macrophages

Published: March 14, 2018
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Summary

Ce protocole décrit la fabrication de surfaces de verre de qualité optique adsorbé avec des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue qui peuvent être utilisés pour surveiller la fusion des macrophages de spécimens vivants et permet de microscopie de Super-résolution d’échantillons fixés .

Abstract

Visualisation de la formation de cellules géantes multinucléées (MSG) de spécimens vivants a été difficile due au fait que plus les techniques d’imagerie live nécessitent de propagation de la lumière à travers le verre, mais sur verre fusion des macrophages est un événement rare. Ce protocole présente la fabrication de plusieurs surfaces de verre de qualité optique où adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue transforme verre en une surface coniques. Tout d’abord, la préparation des surfaces de verre propre comme matériau pour la modification de la surface de départ est décrite. En second lieu, une méthode est fournie pour l’adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue pour convertir les non-coniques verre en un substrat coniques. Troisièmement, ce protocole décrit fabrication de surface micropatterns qui favorisent un degré élevé de maîtrise spatio-temporelle de formation MGC. Enfin, la fabrication de vaisselle en verre bas est décrite. Des exemples d’utilisation de ce système de cellules in vitro comme modèle pour étudier la fusion des macrophages et formation MGC sont montrés.

Introduction

La formation de MSG accompagne un certain nombre d’états pathologiques dans le corps humain se distingue par une inflammation chronique1. Malgré l’accord qui les macrophages mononucléés se fusionnent pour former MSG2, étonnamment peu d’études ont montré de fusion dans le contexte de vie des spécimens de3,4. C’est parce que les surfaces de verre propre qui sont requis pour la plupart des techniques d’imagerie ne favorisent pas la fusion des macrophages quand induit par des cytokines inflammatoires5. En effet, si le verre propre est utilisé comme substrat pour la fusion des macrophages, puis faible aux objectifs intermédiaires de grossissement (c.-à-d., X 10-20) et plus de 15 h de continu imagerie doivent souvent d’observer un événement unique fusion.

Sur l’autre main, les surfaces en plastique coniques (p. ex., permanox) ou plastique qualité bactériologique promouvoir fusion2. Toutefois, l’imagerie par le biais de plastique est problématique car le substrat est épais et disperse la lumière. Ce qui complique l’imagerie depuis longtemps des objectifs de distance (LWD) de travail sont nécessaires. Toutefois, les objectifs de GDL ont habituellement basse lumière rassemblant la capacité par rapport à leurs homologues de la lamelle couvre-objet-corrigé. En outre, techniques qui exploitent des changements dans la polarité de la lumière passant à travers l’échantillon comme le contraste interférentiel différentiel sont impossibles, car le plastique est biréfringent. Les obstacles liés à l’utilisation de plastique sont encore soulignées par le fait qu’il est impossible de prédire où formation fusion/MGC macrophage se produira sur la surface. Ensemble, ces restrictions limitent la visualisation de la fusion des macrophages à l’optique de contraste de phase, étendue des durées d’imagerie totales (> 15 heures consécutives) et en basse résolution.

Récemment, nous avons identifié une surface de verre hautement fusogène tout en menant la microscopie seule molécule Super-résolution avec macrophages fixes/MSG4. Cette observation a été surprenant parce que nettoyer le verre surfaces promouvoir fusion au très faible taux de ~ 5 % après 24 h en présence de l’interleukine-4 (IL-4), tel que déterminé par la fusion de l’index4. Nous avons constaté que la capacité à promouvoir la fusion était due à la contamination de l’olΘamide. Adsorption d’olΘamide ou d’autres composés contenant de la même façon les hydrocarbures à chaîne longue fait le verre coniques. La plupart fusogène composé (paraffine) a été MICROIMPRIMEES, et il donnait un haut degré de contrôle spatio-temporelle sur fusion des macrophages et une augmentation de 2 fois le nombre d’événements de fusion observée dans le même laps de temps par rapport à permanox. Ces surfaces de qualité optique a fourni le premier coup de œil sur les caractéristiques morphologiques et cinétique qui régissent la formation des MSG dans les spécimens vivants.

Dans ce protocole, nous décrivons la fabrication d’une variété de surfaces de verre qui peut être utilisé pour suivre la formation de MSG de spécimens vivants. En outre, nous montrons que ces surfaces soient prêtent à des techniques de champ lointain Super-résolution. Fabrication de surface dépend de l’objectif de l’expérience, et chaque surface est décrite avec des exemples dans le texte de la procédure.

Protocol

Les procédures qui utilisent des animaux ont été approuvées par les comités d’utilisation à la Mayo Clinic, Campus de recherche Janelia et Arizona State University et animalier. 1. préparer la lamelle couvre-objet nettoyé à l’acide Remarque : couvercle en verre acheté chez de nombreux fabricants n’est peut-être pas aussi propre comme prévu. Envisager de nettoyage régulièrement des lots de la lamelle couvre-objet avant toute procédure lorsqu’il …

Representative Results

Les paramètres physico-chimiques de matériaux ont des effets dramatiques sur l’étendue des macrophages fusion7,8,9,10. En outre, contaminants de surface sont connus pour favoriser des macrophages fusion11. Par conséquent, il est important de commencer par nettoyer lamelle couvre-objet comme témoin négatif pour la fusion des macrop…

Discussion

La nécessité d’identifier et de développer par la suite les surfaces de verre de qualité optique qui favorisent la fusion des macrophages découlait du fait que, jusqu’à l’étude non publiée récemment directement visualisé la fusion des macrophages dans le cadre de vie des spécimens3, 4. Cela est dû au fait que fusogène surfaces plastiques qui sont couramment utilisés nécessitent objectifs GDL et sont en grande partie limitées à l’optique de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Ugarova et chercheurs au centre de métabolisme et de la biologie vasculaire pour une discussion utile de ce travail. Faust de James tient à exprimer sa gratitude pour les instructeurs du cours de l’European Molecular Biology Laboratory Super résolution microscopie en 2015. Nous tenons à remercier Satya Khuon Janelia pour aide à la préparation de l’échantillon pour LLSM. Au cours de l’examen et le tournage des parties de ce document, James Faust était soutenue par une bourse T32 (5T32DK007569-28). Le composant de feuille de lumière de treillis de ce travail a été soutenu par HHMI et Betty et Gordon Moore Foundation. T.U. est financé par les NIH grant HL63199.

Materials

Plasma cleaner Harrick Plasma PCD-32G
Finder grid Electron microscopy sciences G400F1-Au any gold TEM grid will work
Cover glass (22×22 mm) Thor Labs CG15CH use only high stringency cover glass
Paraffin wax Sigma Aldrich 17310
Petrolatum Sigma Aldrich 16415 must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide Sigma Aldrich O2136 prepare fresh
Isopropanol Sigma Aldrich 278475
Toluene Sigma Aldrich 244511
Acetone VWR International BDH1101
Ethanol Electron microscopy sciences 15050 use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid Fischer Scientific A144C-212 use to acid wash cover glass
Slyguard 184 VWR International 102092-312 mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish Santa Cruz Biotech sc-351864
Dumont no. 5 forceps Electron microscopy sciences 72705 ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS Atlanta Biological S11550
DMEM:F12 Corning 10-092 contains 15 mM HEPES
Pen/Strept Corning 30-002-Cl
HBSS Corning 21-023
BSA solution Sigma Aldrich A9576 use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4 Genscript Z02996 aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J Jackson Laboratory 000664 use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice n/a n/a use for live fluorescence imaging
Kimwipe Kimberly Clark  34155 use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces

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Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Heddleston, J., Chew, T., Lampe, M., Balabiyev, A., Ros, R., Ugarova, T. P. Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion. J. Vis. Exp. (133), e56866, doi:10.3791/56866 (2018).

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