Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.
Oplosbare N– ethylmaleimide gevoelige fusion eiwit (NSF) bijlage eiwit receptor (SNARE) eiwitten zijn sleutel voor het membraan mensenhandel, zoals zij membraan fusion in eukaryote cellen katalyseren. De SNARE-eiwitten-familie bestaat uit ongeveer 36 verschillende leden. Specifieke intracellulair transportroutes worden gekatalyseerd door bepaalde groepen van 3 of 4 SNARE-eiwitten die aldus bij te aan het specifieke karakter dragen en de trouw van membraan mensenhandel. Echter, het bestuderen van de precieze functie van SNARE-eiwitten is technisch uitdagend, omdat SNAREs zijn zeer overvloedig en functioneel overbodig, met de meeste SNAREs hebben meerdere en overlappende functies. In dit protocol, wordt een nieuwe methode voor de visualisatie van SNARE complexvorming in levende cellen beschreven. Deze methode is gebaseerd op het uiten van SNARE-eiwitten C-terminaal gesmolten aan fluorescerende eiwitten en hun interactie meten door Förster resonance energy transfer (FRET) en fluorescentie levensduur microscopie (FLIM) imaging. Door het aanbrengen van de fluorescentie levensduur histogrammen met een multicomponent verval model, staat FRET-FLIM (semi-) kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNARE complexvorming bij verschillende blaasjes. Dit protocol heeft met succes zijn toegepast om te visualiseren SNARE complexvorming op het plasma-membraan en endosomal compartimenten in zoogdiercellen lijnen en primaire immune cellen, en kan gemakkelijk worden uitgebreid om te studeren SNARE functies op andere organellen in dier, plant en schimmel cellen.
Membraan mensenhandel is een centraal kenmerk van eukaryote cellen, waar membraan blaasjes bud af van een donor organel en verplaats naar en zekering met een doel organel1,2. Met uitzondering van de mitochondriën, zijn al deze membraan fusion stappen gekatalyseerd door leden van de SNARE-eiwit familie1,2. De SNARE-eiwitten-familie bestaat uit ongeveer 36 leden in zoogdiercellen en ongeveer 20 leden in gist2. SNARE-eiwitten bevatten één of twee ~ 52 residuen durende, native ongestructureerde regio’s, genaamd SNARE-motieven. SNARE-eiwitten zijn het vaak vastgebonden aan membranen door een C-terminal transmembraan helix1,2. Strikken kunnen worden ingedeeld op basis van de centrale residuen die zij aan de complexe SNARE in arginine (R) en glutamine (Q) SNAREs1,2 bijdragen. Membraan fusie wordt gedreven door de interactie van 3 of 4 cognaat SNAREs die samen bijdragen 4 SNARE-motieven en zijn verdeeld over zowel de donor en de acceptor membraan1,2. Een SNARE-complex bestaat uit een R-SNARE motief en drie Q-SNARE motieven (zogenaamde Qc, QA- en Qb). Complexvorming begint bij de N-termini van de SNARE-motieven, vormen een zogenaamde trans-SNARE-complex, en de opbrengst naar de C-termini, vormen een strakke α-Helix spiraalsnoer-spoel bundel genoemd een cis-SNARE-complex. De complexvorming van zelfs een enkele SNARE complexe sleept de donor en acceptor membranen samen en overwint de energie barrière voor membraan fusion3.
Verschillende SNARE complexen toe te wijzen aan specifieke transportroutes binnen cellen is vaak technisch uitdagend. Hoewel SNAREs duidelijk aan de specificiteit van membraan mensenhandel bijdragen, ze zijn promiscue, functioneel overbodig, en hun functies overlappen1,2. Vanwege dit, perturbation experimenten gericht op strikken, zoals door gene knock-out, RNA-interferentie, de invoering van het blokkeren van antilichamen of met oplosbare SNARE fragmenten fungeert als dominante negatieven, vaak niet leiden tot duidelijke fenotypen als andere Strikken compenseren2,4. Bovendien, het is moeilijk om te onderscheiden van specifieke membraan fusion stappen van upstream mensenhandel gebeurtenissen, omdat SNAREs kunnen worden betrokken in meerdere vervoer routes2. Studies van de lokalisatie van strikken door microscopie benaderingen, met behulp van immunolabeling of genetische fusion aan fluorescerende verslaggever eiwitten, last hebben van de problemen die: (i) SNAREs vinden om meerdere organellen, zoals zij vaak meerdere mensenhandel stappen, en (ii bemiddelen) hun lokalisaties bedoel niet automatisch dat ze bezig zijn functioneel SNARE complexvorming. Tot slot, SNARE complexen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunoprecipitation experimenten met behulp van een van de SNAREs als aas en de andere SNAREs als doelen, maar dit kan geen toewijzing van deze complexen aan specifieke organellen of aanvoerroutes. Er is op dit moment dus niet alternatieve techniek te visualiseren SNARE complexen met organellar resolutie. Immunofluorescentie is niet in staat om te bewijzen SNARE interacties maar prima overweg met alleen de aan- of afwezigheid van co lokalisatie, terwijl immunoprecipitation alleen overweg met SNARE-interacties in de hele cel bevolking maar niet toewijzen de organellen waar deze interacties plaatsvinden.
Om deze beperking ondervangen ontstond een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van SNARE complexen in levende cellen met organellar resolutie waardoor onlangs door Verboogen et al. 5 deze methode is gebaseerd op de expressie van paren van strikken met spectraal verschoven fluorescente proteïnen gesmolten C-terminaal aan hun transmembraan helices. Na voltooiing van de membraan kernversmelting en de vorming van een GOS-complexe SNARE, deze fluorophores op de C-termini voor de transmembrane helices zijn onmiddellijk naast elkaar. De fluorophores zijn dan ruim binnen de Förster-afstand (meestal < 5 nm), resulterende in FRET uit de fluorophore van de donor groen-verschoven naar de rood-verschoven acceptor fluorophore5,6. FRET resultaten in het blussen van de donor fluorophore en een verhoogde uitstoot van de acceptor-fluorophore die kan worden gemeten vanaf de verhoudingen van de donor en acceptor emissie (ratiometric FRET). Echter ratiometric FRET tussen twee verschillende moleculen is uitdagend, vanwege fluorescentie cross-talk en verschillende niveaus van de donor en acceptor SNAREs op verschillende organellen en tussen cellen7,8. FRET kan ook worden gemeten vanaf de levensduur van de fluorescentie, die de tijd tussen de excitatie en de emissie van een foton is. Als de donor fluorophore kan het vrijgeven van zijn energie door FRET, dit concurrerende resultaat van het proces in een schijnbare verkorting van de levensduur van de fluorescentie. Dit kan worden gemeten door FLIM7,8. Levensduur FRET is veel krachtiger dan ratiometric FRET voor het meten van interacties tussen twee verschillende moleculen, zoals de levensduur van de fluorescentie een intrinsieke eigenschap van een fluorophore is en ongevoelig voor de concentratie is. Bovendien is de FRET door onderlinge aanpassing kwantitatieve, omdat de efficiëntie van de FRET omgekeerd evenredig met de zesde kracht van de afstand tussen de donor en acceptor fluorophores (in wezen een stap-functie is). Dus, door het aanbrengen van de fluorescentie levensduur histogrammen opgenomen door FLIM met een dubbel-component verval model, FRET-FLIM voorziet in de (semi-) kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNARE moleculen die zich bezighouden met SNARE complexvorming5.
Onlangs, deze methode FRET-FLIM werd gebruikt door Verboogen et al. om te visualiseren SNARE complexvorming in primaire dendritische cellen van het immuunsysteem-5. Het bleek dat na het ontmoeten van een pathogene stimulans, dendritische cellen omleiden hun membraan handel gepaard met een verhoogde complexvormers verwijderd van de R-SNARE membraan van het vesikel-geassocieerde proteïne (VAMP) 3 met de Qa-SNARE-syntaxin 4 specifiek gericht is op de Plasmamembraan. Deze verhoogde SNARE complexvorming is waarschijnlijk nodig om te voldoen aan de verhoogde secretoire capaciteit voor de afscheiding van inflammatoire cytokinen zoals Interleukine-65. Dit protocol beschrijft de experimentele stappen die nodig zijn voor de verwerving van FRET-FLIM gegevens voor de visualisatie en (semi-) kwantitatieve meting van SNARE complexen.Hoe passen de histogrammen levensduur geheel-cel fluorescentie met mono – en bi-exponentiële functies van verval, wat resulteert in de schijnbare fluorescentie levensduur als een kwantitatieve schatting te SNARE interacties wordt uitgelegd. In dit protocol, de gebruikte HeLa cellenvariëteit wordt gebruikt als een voorbeeld, maar de methode kan gemakkelijk worden uitgebreid bestuderen SNARE complexen in andere eukaryotische cellen.
Dit protocol demonstreert het gebruik van de FRET-FLIM voor visualisatie van SNARE interacties tussen syntaxin 4 en VAMP3 in levende HeLa cellen. Syntaxin 4 is een Qa-SNARE-eiwit overwegend lokaliseren op het plasma-membraan waar het bemiddelt exocytose1,,2,,20,21. VAMP3 is een R-SNARE, die voornamelijk wordt beschreven om te zoeken op recycling endosomal compartimenten en bemiddelt mensenhandel aan andere Endosomen alsook over het plasmamembraan1,2,20. De FRET-FLIM bepaling kan echter gemakkelijk aangepast voor het bestuderen van andere SNARE-eiwitten. De enige voorwaarde is dat deze SNAREs een C-terminal transmembraan helix bevatten, dat is het geval voor de meeste SNARE-eiwitten door ver1,2. Bovendien is het protocol hier beschreven kan worden aangepast voor visualisatie van SNARE complexen in elk type van eukaryotische cel, met inbegrip van planten en gist. In dit protocol gebruikten we de verkorting van de levensduur van de fluorescentie van de donor fluorophore als een maatregel van de FRET. Als een complementaire aanpak, de levensduur van de acceptor-fluorophore kan worden bestudeerd, omdat de gesensibiliseerde emissie veroorzaakt een duidelijke stijging fase waarin ondubbelzinnig bewijs dat energie-overdracht van resonantie plaatsvindt.
Op dit moment kan de FRET-FLIM techniek niet kunnen visualiseren SNARE complexen in lysosomale compartimenten. Voor 3-mCitrine-mCherry tandem constructie voor de syntaxin kan de mCherry-fluorescentie vaak worden gevonden meer geaccumuleerde in een gebied van juxtanuclear, die waarschijnlijk overeenkomt met lysosomale compartimenten, overwegende dat het mCitrine signaal meer overvloedig in de mobiele periferie5. Een soortgelijke juxtanuclear accumulatie van mCherry ten opzichte van mCitrine werd waargenomen, toen de dezelfde SNARE-eiwitten aan deze TL eiwitten gesmolten mede uitgedrukt5 waren. Lysosomen worden gekenmerkt door een extreem lage pH (< 4) en een hoge activiteit van Proteolytische enzymen. De accumulatie van de juxtanuclear van mCherry wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een hogere weerstand van de mCherry fluorophore tot lysosomale verslechtering ten opzichte van de mCitrine fluorophore. Het is niet te wijten aan de pH-blussen van mCitrine, zoals juxtanuclear accumulatie van mCherry treedt ook op bij fixatie van de cellen5. Dus, de FRET-FLIM techniek onderschat de hoeveelheid FRET in de juxtanuclear (lysosomale) regio’s en dit zou vereisen andere tl verslaggever eiwitten die de barre omstandigheden binnen de lumen van lysosomen overleven.
FRET-FLIM in beginsel kunt verkrijgen van een (semi-) kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNAREs in complexe5. Zoals we hebben uitgelegd in dit protocol, moet de montage van de fluorescentie levensduur histogrammen met dubbele-exponentiële afname functies (vergelijking 2), waar de amplitude van de snelle component is evenredig aan de Fractie van de SNAREs in complexe) Vergelijking 3). Dergelijke montage met een tweecomponenten-model is echter technisch uitdagende. Montage met meerdere gratis fit parameters (twee fluorescentie levens en twee amplitudes) vereist een zeer groot aantal fotonen, vooral omdat de parameters elkaar beïnvloeden zullen en kleine fouten in het leven zal van invloed zijn op de amplitudes en vice versa. Om deze problemen van de montage, de levensduur van de fluorescentie van de langzame component kunnen worden vastgesteld om de levensduur van de donor enige voorwaarde (dat wil zeggen, geen FRET; alleen mCitrine aanwezig) en die van de snelle component aan de levensduur van de tandem bouwen) maximale verwachten FRET). Echter, dit moet ook worden uitgelegd met zorg, omdat de levensduur van de fluorescentie mogelijk niet hetzelfde als in de Staten van deze controle, en vanwege meerdere redenen (zelf blussen, dipool oriëntatie, variaties in de communicatie afwijken kunnen). Meerdere SNARE complexen in de nabijheid (< 10 nm) kan leiden tot afstand-afhankelijke FRET, hetzelfde principe waarmee FRET moet worden gebruikt als een “moleculaire heerser”, maar in dit geval, verduistert de kwantificering van de SNARE complexen. Bovendien, een kwantitatief in te schatten is niet altijd zinvol, omdat de gelabelde SNAREs met endogene (labelloze) strikken concurreren. Het niveau van de expressie van mCherry-label SNARE is dientengevolge een belangrijkste determinant voor het percentage FRET5. Vanwege al deze kanttekeningen, is het aanbevolen om passen de fluorescerende levensduur histogrammen met een mono-exponentiële afname functie (vergelijking 1). Dit heeft het voordeel dat het vereist niet enige een priori kennis van de levensduur en de resulterende schijnbare gemiddelde TL levensduur een solide maatregel voorziet in SNARE complexvormers5.
Verwacht wordt echter dat kwantitatieve FRET-FLIM beeldvorming door tweecomponenten montage modellen potente toekomstige toepassingen zal hebben. SNARE-encoding genen binnen het chromosoom kunnen worden gesmolten met fluorescerende verslaggever eiwitten, bijvoorbeeld door CRISPR/CAS9. Dit resulteert in de fluorescerende etikettering van endogene SNARE-eiwitten, met endogene eiwitniveaus en geen achtergrond van labelloze strikken, en daarmee zorgt voor een zinvolle kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNARE complexen door FRET-FLIM. Terwijl de expressie niveaus van endogene SNAREs kunnen worden vrij laag en geven relatief lage fluorescerende signalen, de verwachting is dat een voldoende aantal fotonen kan worden verkregen, vooral voor de hele cel FLIM (die vereist slechts een paar 1,000s van fotonen). Bovendien, deze FRET-FLIM metingenmogen met gevoeliger lawine fotodiode detectoren die ook in hogere fluorescentie signalen en betere statistieken van het foton resulteren zal.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een Hypatia fellowship van het Radboud universitair medisch centrum, een carrière ontwikkeling Award van het Human Frontier Science Program, de zwaartekracht programma 2013 van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijkonderzoek (NWO; ICI-024.002.009), een VIDI-subsidie van NWO (ALW VIDI 864.14.001), en een Starting Grant van de Europese Onderzoeksraad (EOR) onder het zevendekaderprogramma van de Europese Unie (Grant overeenkomst nummer 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |