该协议描述了一种新的方法, 允许定量可视化的复杂形成的圈套蛋白, 基于 rster 共振能量转移, 和荧光寿命成像显微镜。
可溶性的N-ethylmaleimide 敏感融合蛋白 (NSF) 附着蛋白受体 (诱捕) 蛋白是膜交易的关键, 因为它们催化了真核细胞中的膜融合。诱捕蛋白家族由大约36不同的成员组成。特定的细胞内转运路线是由3或4诱捕蛋白的特定集合催化的, 从而有助于膜交易的专一性和保真度。然而, 研究诱捕蛋白的精确功能是技术上的挑战, 因为圈套是高度丰富和功能冗余, 与大多数陷阱具有多重和重叠的功能。在该协议中, 描述了一种新的在活细胞中诱捕复杂编队的可视化方法。这种方法的基础是表达圈套蛋白 c-终末期融合到荧光蛋白和测量其相互作用的 rster 共振能量转移 (苦恼) 使用荧光寿命成像显微镜 (电影)。利用多组分衰变模型拟合荧光寿命直方图, 电影允许 (半) 定量估计不同囊泡中圈套复合体的分数。该协议已成功地应用于可视化圈套复杂的形成在细胞膜和在内涵舱室在哺乳动物细胞线和主要免疫细胞, 并且可以容易地扩展到研究圈套作用在其他器官器在动物、植物和真菌细胞。
膜的贩运是真核细胞的一个中心特征, 其中膜泡芽从一个捐献者的细胞器, 然后移动到和融合的目标器1,2。除线粒体外, 所有这些膜融合步骤都是由诱捕蛋白家族的成员1,2来催化的。圈套蛋白质家庭包括大约36名成员在哺乳动物细胞和大约20名成员在酵母2。诱捕蛋白包含一或两个 ~ 52 残滓-长, 本机非结构化的区域, 叫圈套主题。圈套蛋白质经常栓对细胞膜由 C 末端跨膜螺旋1,2。圈套可以被分类根据他们贡献对圈套复合体的中央残滓入精氨酸 (R) 和谷氨酰胺 (Q) 圈套1,2。膜融合是由3或4同源圈套的相互作用驱动, 共同贡献4圈套-主题和被分布在施主和受体膜1,2。网罗情结由一个 R 圈套主题和三 Q 圈套主题 (被称为 Qa, qb/t, 和 Qc) 组成。复杂的编队开始于陷阱图案的 N 个终点, 形成一个 so-called 的反式-圈套-复合体, 并向 C 终点的方向, 形成一个紧凑的α-螺旋盘绕卷束称为一个cis-圈套-复杂。甚至一个单一的圈套复合体的复杂形成将施主和受体膜结合在一起, 克服了膜融合的能量屏障3。
将不同的圈套配合物分配给细胞内的特定运输路线通常是技术上的挑战。虽然圈套明显地贡献了膜交易的特殊性, 他们是混杂的, 功能上多余的, 并且他们的作用重叠1,2。因此, 针对圈套的摄动实验, 如基因敲除、RNA 干扰、阻断抗体的引入, 或以可溶解的圈套片段作为显性阴性, 往往不会导致明显的表型陷阱补偿2,4。此外, 很难区分特定的膜融合步骤与上游贩运事件, 因为陷阱可以涉及多个运输路线2。利用显微镜方法对诱捕器进行定位研究, 使用 immunolabeling 或遗传融合对荧光报告蛋白, 有以下问题: (i) 陷阱定位到多个细胞器, 因为他们经常调解多个贩运步骤, 和 (ii)他们的定位并不自动意味着他们在功能上参与圈套复杂的形成。最后, 圈套复合体可以用沉淀实验来确定, 使用陷阱作为诱饵, 其他陷阱作为目标, 但这不允许把这些配合物分配给特定的细胞器或贩运路线。因此, 目前, 没有替代技术, 以可视化的圈套配合与 organellar 的决议。免疫荧光是不能证明圈套的相互作用, 但只能显示共存的存在或缺席, 而沉淀只可以显示圈套互动在整个细胞的人口, 但没有分配的器在这些交互发生。
为了克服这些限制, 新的方法, 允许定量可视化的活细胞中的圈套配合物的 organellar 分辨率最近开发了 Verboogen et al.5此方法基于光谱移位的荧光蛋白对其进行跨膜螺旋的表达。在完成了膜融合和形成一个cis-圈套复杂, 这些荧光在 C 总站的跨膜螺旋立即并列。荧光是然后在 rster 距离 (通常和 #60; 5 毫微米), 导致烦恼从绿色转移的施主荧光对红色被转移的接受者荧光5,6。焦虑的结果是在供体荧光的淬火和受体荧光的增加的排放量可以从施主和受体的比值 (比率烦恼) 来衡量。然而, 比率烦恼之间的两个不同的分子是具有挑战性的, 因为荧光相声和不同层次的施主和受体圈套在不同的细胞器和单元之间7,8。烦恼也可以从荧光寿命, 这是时间之间的激发和发射的光子。如果施主荧光能通过烦恼释放它的能量, 这竞争的过程导致明显缩短荧光寿命。这可以通过电影7,8来衡量。寿命烦恼比比率焦虑更健壮的是测量两个不同分子间的相互作用, 因为荧光寿命是荧光的内在属性, 对它的浓度不敏感。此外, 烦恼是由近似定量, 因为烦恼的效率是成反比的第六力量的距离之间的捐助者和受体荧光 (基本上是一个步骤功能)。因此, 通过拟合电影双衰变模型记录的荧光寿命直方图, 电影允许对参与圈套复杂编队的圈套分子的分数进行 (半) 定量估计.5。
最近, Verboogen et al.使用了这种电影方法在免疫系统的原树突状细胞中可视化圈套复杂的形成5。结果表明, 在遇到致病刺激后, 树突状细胞将其膜的贩运重新路由, 伴随着 R 圈套囊泡相关膜蛋白 (鞋面) 3 的增加络合, 而 Qa 陷阱 syntaxin 4 特别在等离子膜。这种增加的圈套复杂的形成可能需要满足增加分泌能力的分泌炎症细胞因子, 如 interleukin-65。本协议描述了在电影数据的可视化和 (半) 定量测量圈套配合物所需的实验步骤。解释了如何将全细胞荧光寿命直方图与单、双指数衰减函数相适应, 从而使视荧光寿命成为诱捕相互作用的定量估计。在这个协议中, 广泛使用的 HeLa 细胞线作为一个例子, 但该方法可以很容易地扩展到研究圈套复合物的其他真核细胞。
该协议展示了使用电影的 syntaxin 4 和 VAMP3 在活 HeLa 细胞的圈套相互作用的可视化。Syntaxin 4 是一种 Qa 陷阱蛋白, 主要定位在细胞膜上, 它介导胞1,2,20,21。VAMP3 是一个 R 圈套主要被描述在回收内涵隔间并且斡旋贩卖到其他体并且对血浆膜1,2,20。然而, 电影的检测可以很容易地适应研究其他诱捕蛋白。唯一的条件是, 这些陷阱包含一个 c-终端跨膜螺旋, 这是大多数诱捕蛋白的情况下, 远1,2。此外, 这里所描述的协议可以适用于任何真核细胞类型的圈套配合物的可视化, 包括植物和酵母。在本协议中, 我们使用缩短的荧光寿命的捐助者荧光作为一种措施的烦恼。作为一种互补的方法, 可以检查受体荧光的寿命, 因为致敏发射会产生一个明显的上升阶段, 从而提供了共振能量传递的明确证明。
目前, 电影技术可能无法想象在溶酶体舱室的圈套复合物。对于 syntaxin 3-mCitrine-mCherry 串联结构, mCherry 荧光往往可以发现更多的积累在 juxtanuclear 地区, 这可能对应于溶酶体舱室, 而 mCitrine 信号是更丰富的细胞外围5。mCherry 与 mCitrine 的相似的 juxtanuclear 积累被观察了, 当同样诱捕蛋白质熔化了到这些荧光蛋白质是 co-expressed 的5。溶酶体的特点是极低的 pH 值 (和 #60; 4) 和高活性的蛋白酶。与 mCitrine 荧光相比, mCherry 的 juxtanuclear 积累可能是由于 mCherry 荧光对溶酶体降解的抗性较高。这不是由于 pH 猝灭的 mCitrine, 因为 juxtanuclear 积累的 mCherry 也发生在固定的细胞5。因此, 电影技术低估了 juxtanuclear (溶酶体) 地区的烦恼量, 这将需要其他的荧光报告蛋白, 生存在严酷的条件内溶酶体流明。
电影原则上允许在复杂的5中获得对陷阱分数的 (半) 定量估计。正如我们在本协议中所解释的, 这需要用 double-exponential 衰变函数 (方程式 2) 来拟合荧光寿命直方图, 其中快速分量的振幅与复杂的圈套的分数成正比 (公式 3)。然而, 这样的配件与两个组成部分的模型是技术上的挑战。拟合与多个自由拟合参数 (两个荧光寿命和两个振幅) 需要大量的光子, 特别是因为参数将相互影响和小错误的寿命将影响的振幅和副反之亦然。为了克服这些拟合问题, 慢分量的荧光寿命可以固定到供者唯一条件的寿命 (即, 不烦恼; 只有 mCitrine 存在) 和快速分量对串联结构寿命的影响 (最大预期烦恼)。然而, 这也应该被解释与关心, 因为荧光寿命可能不是相同的在这些控制状态, 并且可能偏离由于多重原因 (灭, 偶极取向, 变化在微环境)。多圈套在接近的接近度 (和 #60; 10 nm) 可能导致距离依赖苦恼, 同样的原则, 允许烦恼被用作 “分子统治者”, 但在这种情况下, 掩盖了定量的圈套复合物。此外, 定量估计并不总是有意义的, 因为标记的陷阱与内生 (未标记的) 陷阱竞争。结果, mCherry 标记的圈套的表达水平是一个主要决定因素为焦虑的百分比5。由于所有这些警告, 建议使用单指数衰减函数 (公式 1) 来拟合荧光寿命直方图。这有一个优点, 即它不需要任何先验知识的寿命和由此产生的明显的平均荧光寿命提供了一个坚实的衡量圈套络合5。
然而, 预计两组分拟合模型的定量电影成像将具有很强的应用前景。染色体内的圈套编码基因可以与荧光报告蛋白融合, 例如 CRISPR/CAS9。这就导致了内源性诱捕蛋白的荧光标记, 具有内生蛋白水平, 无标记圈套的背景, 从而允许对电影的圈套复合物的分数进行有意义的定量估计。虽然内生陷阱的表达水平可能相当低, 并给予相对较低的荧光信号, 但预计将获得足够数量的光子, 特别是对整个细胞电影 (只需要几个1,000 的光子)。此外, 这些电影测量可以执行更敏感的雪崩光电二极管探测器, 这也将导致更高的荧光信号和更好的光子统计。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了来自内梅亨大学医学中心的希帕蒂亚奖学金的支持, 这是从人类前沿科学项目的职业发展奖, 来自荷兰科学研究组织的万有引力方案 2013 (NWO;ICI-024.002.009), NWO (ALW 了 864.14.001) 的了赠款, 以及欧洲联盟第七框架方案下的欧洲研究理事会 (紧急救济协调员) 的起始赠款 (赠款协议编号 336479)。
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |