Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine
Summary
Nous présentons ici une électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée à la spectrométrie de masse (MS) pour séparer et identifier le protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine, qui présente un motif de 2DE bon et reproductible. Plusieurs protéines sont observées dans chaque endroit de 2DE lors de l’analyse complexe cancer proteome avec l’utilisation de MS de haute sensibilité.
Abstract
Adénome hypophysaire humaine (PA) est une tumeur commune qui se produit dans l’hypophyse humaine dans les systèmes d’axes orgue hypothalamus-pituitaire-ciblées et peut-être être classifiée comme PA soit cliniquement fonctionnel ou non fonctionnel (FPA et NFPA). NFPA est difficile pour le diagnostic de stade précoce et le traitement en raison de l’élévation à peine les hormones dans le sang par rapport à la FPA. Notre objectif à long terme consiste à utiliser des méthodes de la protéomique pour découvrir des biomarqueurs fiables de clarification des mécanismes moléculaires de la PA et reconnu efficaces marqueurs diagnostiques, pronostiques et cibles thérapeutiques. Efficace électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse (MS) ont été présentés ici pour analyser des protéomes PA humains, y compris la préparation d’échantillons, électrophorèse 2D, visualisation de protéines, analyse d’image, en gel la digestion trypsique, empreinte digitale masse de peptide (CMR) et tandem de masse spectrométrie (MS/MS). 2-dimensional gel électrophorèse laser assistée par matrice désorption-ionisation spectrométrie de masse PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS et MS/MS des chromatographie en 2DE (LC) procédures ont été appliquées avec succès dans une analyse du protéome de la NFPA. Avec l’utilisation d’un spectromètre de masse de haute sensibilité, plusieurs protéines ont été identifiés avec la méthode 2DE-LC-MS/MS dans chaque endroit dans une analyse du tissu complexe de PA pour maximiser la couverture de la human proteome PA de gel 2D.
Introduction
PA est une tumeur commune qui se produit dans l’hypophyse humaine dans les systèmes d’axe hypothalamus-pituitaire-ciblées orgue, qui jouent un rôle important dans le système endocrinien humain. PA comprend cliniquement fonctionnelles et non fonctionnelles PAs (FPA et NFPA)1,2. NFPA est difficile dans le diagnostic de stade précoce et le traitement en raison de niveaux d’hormones seulement légèrement élevé (p. ex., LH et FSH) dans le sang par rapport à la FPA, qui a considérablement augmenté les niveaux d’hormones correspondantes dans sang3,4 ,,5. La clarification des mécanismes moléculaires et la découverte de biomarqueurs efficaces a une importance clinique dans le diagnostic, traitement et pronostic de la NFPA. Notre objectif à long terme est de développer et utiliser des méthodes protéomiques pour étudier NFPA pour la découverte de biomarqueurs fiables pour clarifier ses mécanismes moléculaires et reconnaître des cibles thérapeutiques efficaces ainsi que des marqueurs diagnostiques et pronostiques. 2-DE couplée avec des méthodes de MS ont été largement utilisés dans notre programme de recherche à long terme au sujet humain PA proteome1,2,6,7, y compris établissement de référence du protéome cartes3,8, analyse de protéines différentiellement exprimés profils9,10,11,12,13, variantes de l’hormone14 ,15, modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation14 et la tyrosine nitration16,17,18, la variation de la protéomique des envahissantes relatif à non invasive NFPAs19et l’hétérogénéité de la protéomique de la NFPA sous-types13, qui a conduit à la découverte des multiples réseaux voie importante (dysfonctionnement mitochondrial, dérèglement du cycle cellulaire, stress oxydatif et signalisation MAPK anomalie du système) qui sont altérées dans NFPA13,19,20.
2de sépare les protéines selon leur point isoélectrique (pI) (focalisation isoélectrique, IEF) et leur poids moléculaire (via sodium dodecyl sulfate polyacrylamide électrophorèse sur gel, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. il s’agit d’une technique de séparation classique et communes dans le domaine de la protéomique, depuis l’introduction des concepts du protéome et protéomique en 1995,24. MS est la technique indispensable pour découvrir l’identité des protéines séparées 2DE, y compris les stratégies FMP et MS/MS. Le développement très rapide des instruments MS, surtout dans les aspects de la sensibilité de détection et de résolution, en combinaison avec l’amélioration du système de LC, qui améliore grandement l’identité des protéines de faible ou très faible abondance dans un proteome pour maximiser la couverture d’un proteome. Il conteste également nos concepts traditionnels qu’une seule ou deux protéines sont présents dans un gel 2D dans une analyse du protéome complexe de tissus humains et offre la possibilité d’identifier plusieurs protéines dans un gel 2D spot dans l’analyse des tissus humains complexes protéome et maximiser la couverture NFPA proteome.
Nous décrivons ici les protocoles détaillés de 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS/MS et 2DE-LC-MS/MS, qui ont été utilisées avec succès dans l’analyse du protéome humain de NFPA. Les protocoles comprennent la préparation des échantillons, tout d’abord de dimension (focalisation isoélectrique, IEF), deuxième dimension (SDS-PAGE), visualisation de protéines (coloration à l’argent et la coloration bleu de Coomassie), analyse de gel 2D, la digestion trypsique de dans-gel, d’image purification de peptides tryptiques, CMR, MS/MS et base de données, saisir3,8,25,26. De plus, ce protocole traduit facilement pour l’analyse des autres protéomes de tissus humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
2de, couplées avec les méthodes MS y compris 2DE-MS PMF et 2DE-MS/MS, a été utilisé avec succès dans notre programme à long terme – l’utilisation de la protéomique pour étudier les variations de protéomiques humaines NFPA et variations de réseau moléculaire pour l’élucidation des mécanismes moléculaires et découverte de biomarqueurs efficaces pour NFPAs. Protéomique comparative basée sur 2de avec bonne reproductibilité joue un rôle important dans l’identification des normes NFPA protéomiques va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81572278 et 81272798 à XZ), les subventions de projet de Plan de la Chine « 863 » (Grant No. 2014AA020610-1 à XZ), les fonds de l’hôpital Xiangya pour Introduction de Talent (à XZ) et le Hunan La Fondation provinciale des sciences naturelles de Chine (subvention no 14JJ7008 à XZ). Les auteurs reconnaissent également la contribution scientifique du Dr Dominic M. Desiderio dans le Health Science Center de l’Université du Tennessee. X.Z. continuellement développé et utilisé méthodes 2DE-SM pour analyser proteome Adénome hypophysaire à partir de 2001, conçu le concept pour le présent manuscrit, a écrit et révisé le manuscrit, a coordonné les travaux pertinent et était responsable de la soutien financier et les travaux correspondant. Y.L. a participé à la révision du manuscrit. Y.H a participé à la collection de références et la révision du manuscrit. Tous les auteurs approuvés le manuscrit final.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
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