نقدم هنا، هلام ثنائي الأبعاد التفريد (2DE) مقترنة بالطيف الكتلي (مللي ثانية) لفصل وتحديد البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية، الذي يعرض نمط 2DE جيدة واستنساخه. ولوحظت العديد من البروتينات في كل بقعة 2DE عند تحليل البروتين السرطان معقدة باستخدام MS حساسية عالية.
الورم الحميد الغدة النخامية البشرية (السلطة الفلسطينية) هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور تحت المهاد-النخامية-استهداف الجهاز، ويمكن أن تصنف السلطة الفلسطينية أما سريرياً وظيفي أو غير وظيفي (FPA و NFPA). ومن الصعب NFPA لمرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب بالكاد رفع مستوى الهرمونات في الدم بالمقارنة مع FPA. هدفنا طويل الأجل لاستخدام أساليب البروتيوميات لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح الآليات الجزيئية السلطة الفلسطينية والاعتراف بعلامات التشخيص، تشخيصية فعالة والأهداف العلاجية. هلام ثنائي الأبعاد فعالة التفريد (2DE) مقترنة بأساليب الطيف الكتلي (مللي ثانية) وعرضت هنا لتحليل البشرية بروتيوميس السلطة الفلسطينية، بما في ذلك إعداد العينات، التفريد جل 2D، التصور البروتين، وتحليل الصور، في جل الهضم التربسين وهضميد بصمة الشامل (تحلان) جنبا إلى جنب كتلة قياس الطيف الكتلي (MS/MS). هلام ثنائي الأبعاد التفريد الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين الكتلي تحلان (2DE–استخدام MS تحلان)، 2DE–استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد أو مرض التصلب العصبي المتعدد، والفصل اللوني السائل 2DE (LC) MS/MS الإجراءات التي طبقت بنجاح في تحليل البروتين NFPA. مع استخدام مطياف كتلة حساسية عالية، حددت العديد من البروتينات باستخدام أسلوب 2DE-LC-MS/MS في جل 2D كل بقعة في تحليل الأنسجة السلطة الفلسطينية معقدة تحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين البشري في السلطة الفلسطينية.
السلطة الفلسطينية هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور الجهاز تحت المهاد-النخامية-المستهدفة، التي تلعب أدواراً هامة في نظام الغدد الصماء الإنسان. وتشمل السلطة الفلسطينية سريرياً وظيفية ولا يعمل نظام تقييم الأداء (FPA و NFPA)1،2. NFPA أمر صعب في مرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب مستويات الهرمون مرتفعة قليلاً فقط (مثلاً، LH و FSH) في الدم بالمقارنة مع FPA، الذي شهد زيادة كبيرة في مستويات الهرمونات المقابلة في الدم3،4 ،5. توضيح الآليات الجزيئية واكتشاف المؤشرات الحيوية فعالة له أهمية سريرية هامة في التشخيص والعلاج، والتكهن من NFPA. هو هدفنا طويل الأجل تطوير واستخدام أساليب البروتين لدراسة NFPA لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح آلياته الجزيئية، والاعتراف بالأهداف العلاجية الفعالة، فضلا عن علامات التشخيص وتنبؤاتها. 2-دي مقترنة بمرض التصلب العصبي المتعدد الأساليب قد استخدمت على نطاق واسع في برنامجنا البحوث طويلة الأجل فيما يتعلق بالإنسان السلطة الفلسطينية البروتين1،2،،من67، بما في ذلك إنشاء مرجع البروتين خرائط3،8، تحليل البروتين الأثران عن ملامح9،10،11،12،13، المتغيرات هرمون14 ،15، التعديلات بوستترانسلاشونال مثل الفسفرة14 وتيروزين نترته16،،من1718، واختلاف البروتين الغازية نسبة إلى موسع نفباس19، وإلى عدم تجانس البروتين NFPA الأنواع الفرعية13، مما أدى إلى اكتشاف عدة شبكات المسار الهام (خلل mitochondrial والتقلبات دورة الخلية، والأكسدة، وإشارات MAPK شذوذ النظام) التي يتم تغييرها في NFPA13،،من1920.
2DE يفصل البروتينات وفقا isoelectric نقطة (pI) (تركز isoelectric، الضمنية) والوزن الجزيئي (عن طريق الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23-هذا أسلوب فصل الكلاسيكي ومشتركة في ميدان البروتيوميات، منذ الأخذ بمفاهيم البروتين والبروتينات في 199524. مرض التصلب العصبي المتعدد هو الأسلوب حاسمة لمعرفة الهوية البروتينات المفصولة 2DE، بما في ذلك استراتيجيات تحلان و MS/MS. التطور السريع جداً لمرض التصلب العصبي المتعدد الصكوك، لا سيما في الجوانب للكشف عن حساسية والقرار، في تركيبة مع تحسين نظام LC، يحسن إلى حد كبير هوية البروتينات وفرة منخفضة أو منخفضة للغاية في البروتين إلى أقصى حد ممكن تغطية البروتين. كما أنه يتحدى مفاهيمنا التقليدية واحدة فقط أو اثنين من البروتينات موجودة في 2D هلام موضعي في تحليل البروتين الأنسجة البشرية المعقدة، ويوفر فرصة للتعرف على البروتينات متعددة في 2D هلام موضعي في تحليل الأنسجة البشرية المعقدة البروتين، وتحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين NFPA.
هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة من 2DE–استخدام MS تحلان، 2DE–استخدام MS/MS، و 2DE-LC-MS/MS التي استخدمت بنجاح في تحليل البروتين NFPA البشرية. البروتوكولات وتشمل إعداد العينات، البعد الأول (isoelectric التركيز، الضمنية)، البعد الثاني (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، تصور بروتينات (تلطيخ الفضة وتلطيخ أخذ الأزرق)، صورة التحليل في 2D هلام، التربسين في جل الهضم، تنقية الببتيدات تريبتيك وتحلان، MS/MS، وقاعدة بيانات الحارقة3،8،،من2526. وعلاوة على ذلك، يترجم هذا البروتوكول بسهولة لتحليل بروتيوميس الأنسجة البشرية الأخرى.
2DE، إلى جانب أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد بما في ذلك تحلان 2DE MS و 2DE–MS/MS، وقد استخدمت بنجاح في برنامجنا الطويل الأجل–استخدام البروتينات لدراسة البشرية NFPA البروتين الاختلافات والتباينات الشبكة الجزيئية للكشف عن الآليات الجزيئية و اكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة نفباس. 2DE المستندة البر…
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81572278 و 81272798 إلى XZ)، والمنح من الصين “863” خطة المشروع (رقم المنحة 2014AA020610-1 إلى XZ) وأموال مستشفى إكسيانجيا “المواهب مقدمة” (XZ)، وفي هونان مؤسسة العلوم الطبيعية المقاطعات في الصين (رقم المنحة 14JJ7008 إلى XZ). الكتاب أيضا تعترف بالمساهمة العلمية للدكتور دومينيك م. ديسيديريو في مركز العلوم الصحية في جامعة تينيسي. X.Z. باستمرار نمواً وتستخدم أساليب 2DE–مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل البروتين الورم الحميد في الغدة النخامية بدءاً من عام 2001 وتصور المفهوم للمخطوطة الحالية وكتب وتنقيح المخطوط، تنسيق العمل ذات الصلة وكان مسؤولاً عن الدعم المالي والعمل المناظرة. وشارك Y.L. في مراجعة المخطوطة. وأي إتش شاركت في مجموعة من المراجع، ومراجعة المخطوطة. ووافق جميع المؤلفين المخطوط النهائي.
Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Urea | VETEC | V900119 | |
SDS | AMRESCO | 0227 | |
CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
TEMED | AMRESCO | M146 | |
Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |