Summary

Изоляция и культивирование нервных прародителей, следуют иммунопреципитации Chromatin гистона 3 лизина 79 Dimethylation марки

Published: January 26, 2018
doi:

Summary

Мы представляем эффективный и воспроизводимый метод для изоляции и культуры клетки-предшественники нейронных от эмбриональных и послеродовой мозговой ткани для chromatin иммунопреципитации (чип) гистона 3 лизина 79 dimethylation (H3K79me2) – гистона знак, расположенный в пределах шаровидные домен гистона 3.

Abstract

Развитие мозга является сложным процессом, который находится под контролем образом височно пространственные градиенты morphogens и различных транскрипционный анализ программ. Кроме того изменения эпигеномные хроматина, как метилирование гистонов, имеют важную роль для установления и поддержания судьбы конкретных ячеек в рамках этого процесса. Подавляющее большинство метилирование гистонов происходит на гибкой гистона хвост, который доступен для гистона модификаторы, ластики и читатель гистоны. В противоположность этому H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3 и вовлечены в различные области развития функций. H3K79 метилирование эволюционно сохраняется и можно найти в широком диапазоне видов от Homo sapiens в Saccharomyces cerevisiae. Изменение происходит в разных клеточных популяций в пределах организмов, включая нейронные прародителями. Расположение H3K79 метилирование в шаровых области гистона 3 делает его трудно оценить. Здесь мы представляем методы для изоляции и корковые прародитель культуры клеток (CPC) от эмбриональных корковых мозговой ткани (E11.5-E14.5) или мозжечковая гранулированных нейрон прародителями (CGNPs) от послеродового ткани (P5-P7), а также эффективно immunoprecipitate H3K79me2 для количественного PCR (ПЦР) и секвенирования генома широкий.

Introduction

Чувств, мотор и когнитивных функций мозга являются весьма сложными и подвержены физическим и экологических изменений. Мозг состоит из трех основных частей Хинд-, средне-и переднего мозга, которые глубоко связаны. В рамках переднего конечного мозга можно разделить на спинной конечного мозга (DT) и брюшной конечного мозга (VT). DT мышей состоит из шести корковых слоев, которые формируются между E11.5 и E18.5 в форме «наизнанку»1. ЖТЛ включает Ганглиозный Высокопреосвященства в развитии, которые впоследствии образуют базальных ганглиев2,3. Несколько типов клеток могут быть классифицированы в млекопитающих центральной нервной системы, таких как нейроны, астроциты или4олигодендроциты, которые развиваются в височно пространственной способом5. Во-первых нейронные прогениторных клеток (НПС) порождают различные виды нейронов, интернейронов и VT, проекции нейронов в DT, а позднее на глиальных клеток (например, астроциты6). Во время разработки коры головного мозга, наиболее поверхностный слой (уровень I), который содержит клетки Кахаля-Ретциуса, формируется сначала. Затем между E12.5 и E14.5, НПС генерировать глубже нейрональных слоёв (VI, V) во время между 14,5 и 16,5, прародители порождают верхний слой (IV-II) нейронов7,8. Нейрональных личность задается путем различных morphogen индуцированной височно пространственной транскрипционный анализ программ и дополнительно эпигеномные программы2.

Мозжечка, который подразумевается в двигательной координации, расположен в задний мозг и развивается между E10 и около P20 в мышей9. Он содержит коры мозжечка и мозжечковая ядер10. Взрослый коры мозжечка состоит из трех слоев, внешний молекулярный слой, слоя клеток Пуркинье и внутренний зернистый слой, содержащий гранулированных нейронов10. Мозжечковая гранул клетки наименьшее нейронов и составляют около 80% всех нейронов мозга позвоночных11. Они развиваются из прекурсоров, расположенных в зоне внешней зародышевого и мигрируют через слой клеток Пуркинье, чтобы их назначения12. Как в конечного мозга, развитие мозжечка регулируется несколько важных morphogens, которые имеют конкретные и пространства зависящие от времени функций и инициировать определенные транскрипционный анализ программы10.

Разработка слои коры и верхней мозжечковой контролируется transcriptional выражением конкретных morphogens и, таким образом, состояние хроматина ДНК. В упрощенном режиме хроматина государства можно разделить на euchromatin как транскрипционно активная и гетерохроматин как транскрипционно немого регионов. Нуклеосома как основной ячейкой хроматина содержит две копии каждого ядра гистона H2A, H2B, H3 и H4, окруженный 147 пар оснований ДНК13. Высоко post-translationally гистонами изменяются путем метилирования, ацетилирования, фосфорилирование, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, дезаминирование и пролина изомеризации14,15. Лизин метилирование гистонов считается наиболее стабильных гистона модификация, которая контролирует транскрипции, репликации, рекомбинация16, повреждение ДНК ответ17и геномный импринтинг18. Lysines может быть моно-, ди-или tri метилированную19 и появляются не только на доступные гистона хвосты, но и внутри шаровидных домена гистонами20. Конкретные methylations H3K4 и H3K36 в основном связаны с euchromatin, конкретных methylations в H3K9, H3K27 или H4K20 главным образом найдены в гетерохроматиновых, хотя все остатки расположены в пределах гистона хвост14, 19,21. H3K79 метилирование расположен в пределах домена шаровидных гистона и был связан с транскрипционный анализ активности, но и с транскрипционно инертных регионах геномной22. Модификация эволюционно сохраняется так, как было отмечено в дрожжи, вилочковой железы теленка, курица и человека23. H3K79 моно, ди и trimethylation (H3K79me1, me2, me3) катализируемые гистона methyltransferases DOT1L24,25 и ядерных SET домен-содержащих белков 2 (Nsd2)26. DOT1L причастен к распространению, репарации ДНК и сотовых перепрограммирования27. Потеря Dot1l в мышах приводит к пренатальной смерти вокруг28,E10.5 стадии развития29. Во время разработки сердца и myocardiocyte дифференциации DOT1L имеет важное значение для ген выражение правила30. В центральной нервной системе, DOT1L функция может быть причастны развития нервной трубки31, он участвует в подавлении Tbr1-выражение во время развития переднего32и может функционировать в регулировании ER-стресс ответ генов33. Контекстно зависимые активации или подавления действий H3K79me, особенно с в естественных условиях ситуаций, как развитие центральной нервной системы, является на сегодняшний день только частично понял32. Так как H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3, он доступен труднодоступных меньше по сравнению с изменения на гибкой гистона хвосты23. Чтобы понять функцию H3K79 метилирование, необходимы методы анализа надежных и воспроизводимых для определения его местоположения и геномная окружающей среды. В этом документе методы мы представляем методы изоляции различных нейронных прародителями (CPC для коры) и CGNPs для мозжечка, эффективное лечение ингибитором DOT1L, и чип метода для анализа метилирования H3K79 через ПЦР или последовательности в разное время очков во время разработки корковых и мозжечка. Обзор протокола и его возможности смотрите Рисунок 1.

Protocol

Благосостояние животных комитетов университета Фрайбурга и местные органы власти одобрил все эксперименты на животных (G12/13, G16/11) упоминается в следующий протокол. 1. Подготовка Подготовка к изоляции CPC Настройка времени спаривания для получения эмбр…

Representative Results

Общая схема нейронных прародитель изоляции, выращивание, H3K79me2 чип и чип методы анализа: На рисунке 1 показана блок-схема для выполнения H3K79me2 чип корковых прогениторных клеток в разное время точках во время развития эмбриональной мозга или пра?…

Discussion

Существует два основных способа для выполнения иммунопреципитации chromatin для выявления геномной размещение изменения гистона, факторов транскрипции, гистонов код читателей, писателей или ластиков. Один метод чип с помощью нуклеиназы переваривается, родной chromatin для иммунопреципитаци?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Генриетта Bertemes за помощь в создании протокола CGN культивирования в лаборатории. Эпигенетики финансируемых DFG медицинской CRC992 этот метод бумага была поддержана финансирование для ТВ. Авторы признают поддержку команды Галактика Фрайбург: Pavankumar Videm, Бьорн Grüning и профессор Рольф Backofen, Биоинформатика, Университет Фрайбурга, Германия финансируется совместных исследований центр 992 медицинской эпигенетики (DFG Грант SFB 2012 992/1) и немецкого федерального министерства образования и научных исследований (BMBF Грант 031 A538A РБК (de. NBI)).

Materials

Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

View Video