Summary

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Published: January 26, 2018
doi:

Summary

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) – een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Abstract

Ontwikkeling van de hersenen is een complex proces, dat wordt gecontroleerd in een temporo-ruimtelijke wijze door gradiënten van morphogens en verschillende transcriptionele programma’s. Epigenetische chromatine wijzigingen, zoals Histon methylering, hebben bovendien een belangrijke rol voor de totstandbrenging en het onderhoud van specifieke cel lot binnen dit proces. De overgrote meerderheid van Histon methylatie optreedt op de flexibele Histon staart, die toegankelijk is voor Histon modifiers, gummen en Histon lezer eiwitten. In tegenstelling, H3K79 methylation bevindt zich in het bolvormige gebied van Histon 3 en is betrokken bij verschillende ontwikkelings functies. H3K79 methylation is evolutionair bewaard en kan worden gevonden in een breed scala van soorten van Homo sapiens naar Saccharomyces cerevisiae. De wijziging treedt op in verschillende cel populaties binnen organismen, waaronder neurale progenitorcellen. De locatie van methylering van de H3K79 in het bolvormige domein van Histon 3 maakt het moeilijk in te schatten. Hier presenteren we methoden om te isoleren en cultuur corticale voorlopercellen cellen (CPC) van embryonale corticale hersenweefsel (E11.5-E14.5) of cerebellaire granulaire neuron progenitoren (CGNPs) van postnatale weefsel (P5-P7), en naar efficiënt immunoprecipitate H3K79me2 voor kwantitatieve PCR (qPCR) en sequentiebepaling van het genoom-brede.

Introduction

De sensorische, motorische en cognitieve functies van de hersenen zijn zeer complex en gevoelig voor fysieke en ecologische veranderingen. De hersenen bestaat uit drie algemene delen de hind-, midden-, en reukkolf, die diep met elkaar zijn verbonden. Binnen de reukkolf, kan de telencephalon worden onderverdeeld in een dorsale telencephalon (DT) en een ventrale telencephalon (VT). De DT van muizen bestaat uit zes corticale lagen die worden gevormd tussen E11.5 en E18.5 in een “binnenstebuiten” manier1. De VT bevat de ganglionaire eminenties in ontwikkeling, die later het vormen van de basale ganglia2,3. Verschillende soorten cellen kunnen worden ingedeeld in de zoogdieren centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten, oligodendrocyten4, of die zich in een temporo-ruimtelijke wijze5 ontwikkelen. Ten eerste, de neurale voorlopercellen (NPC) aanleiding geven tot verschillende soorten neuronen, interneuronen in de VT en projectie neuronen in het DT, en later naar gliale cellen (bijvoorbeeld, astrocyten6). Tijdens de corticale ontwikkeling, de meest oppervlakkige laag (layer ik), die bevat Cajal-Retzius cellen, eerst wordt gevormd. Vervolgens, tussen E12.5 en E14.5, NPC’s genereren diepere neuronale lagen (VI, V) terwijl tussen 14,5 en 16,5, progenitoren aanleiding geven tot7,8van de neuronen van de bovenste laag (IV-II). Neuronale identiteit is opgegeven door de verschillende morphogen-geïnduceerde temporo-ruimtelijke transcriptionele programma’s, en daarnaast door epigenetische programma’s2.

Het cerebellum, die is betrokken bij de coördinatie van de motor, is gelegen in de hindbrain en ontwikkelt tussen E10 en ongeveer P20 in muizen9. Het bevat de cerebellaire cortex en de cerebellaire kernen10. De volwassen cerebellaire cortex bestaat uit drie lagen, de buitenste laag van de moleculaire, het Purkinje cellaag en de binnenste granulaire laag met granulaire neuronen10. De cerebellaire submodule cellen zijn de kleinste neuronen en vertegenwoordigen ongeveer 80% van alle neuronen in de hersenen van de gewervelde11. Ze migreren door het Purkinje cellaag naar hun bestemming12en ontwikkelen van precursoren in de externe germinal zone bevindt. Zoals in de telencephalon, de ontwikkeling van het cerebellum wordt geregeld door verschillende belangrijke morphogens, die hebben specifieke tijd – en ruimte-afhankelijke functies en initiëren gedefinieerd transcriptionele programma’s10.

De ontwikkeling van corticale en cerebellaire lagen wordt gecontroleerd door transcriptionele expressie van specifieke morphogens en, dus, door de staat van de chromatine van het DNA. In een vereenvoudigde weergave, kunnen chromatine-Staten worden onderverdeeld in euchromatine als transcriptionally actief en heterochromatin als transcriptionally stille gebieden. De nucleosoom als de basiseenheid van de chromatine bevat twee kopieën van elke kern Histon H2A, H2B, H3 en H4, omringd door 147 basenparen van DNA13. Histonen zijn zeer post-translationally gewijzigd door methylering, acetylation, fosforylatie, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination en proline isomerisatie14,15. Histon lysine methylering wordt beschouwd als de meest stabiele Histon wijziging die transcriptie, replicatie, recombinatie16, DNA-schade antwoord17en genomische inprenting18 besturingselementen. Lysines worden mono-, di- en tri-gemethyleerd19 en verschijnen niet alleen op de staarten toegankelijk Histon, maar ook binnen het bolvormige domein van histones20. Specifieke methyleringen op H3K4 en H3K36 worden vooral geassocieerd met euchromatine, specifieke methyleringen op H3K9, H3K27 of H4K20 zijn voornamelijk te vinden in de hétérochromatique regio’s, hoewel alle residuen bevinden zich binnen de Histon staart14, 19,21. Methylation van H3K79 is bevindt zich in het bolvormige domein van Histon en geassocieerd met een transcriptionele activiteit, maar ook met transcriptionally inerte genomic regio22. De wijziging is evolutionair bewaard aangezien geconstateerd in gist, kalf zwezerik, kip en menselijke23. H3K79 mono-, di- en trimethylation (H3K79me1, me2, me3) worden gekatalyseerd door de Histon methyltransferases DOT1L24,25 en de nucleaire SET Domain-bevattende eiwitten 2 (Nsd2)26. DOT1L is betrokken bij de proliferatie, DNA-reparatie en mobiele reprograming27. Verlies van Dot1l in muizen leidt tot een prenatale dood rond de ontwikkelingsstadium E10.528,29. Tijdens de ontwikkeling van het hart en bij myocardiocyte differentiatie is DOT1L essentieel voor gen expressie verordening30. In het centrale zenuwstelsel, DOT1L functie kan worden betrokken bij de neurale buis ontwikkeling31, het is betrokken bij het onderdrukken van Tbr1-expressie tijdens reukkolf ontwikkeling32, en kan functioneren in de regulering van ER-stress reactie genen33. De context-afhankelijke activeren of de actie van de bestrijding van H3K79me, vooral met in vivo situaties zoals de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, is tot nu toe slechts gedeeltelijk begrepen32. Aangezien H3K79 methylering zich in het bolvormige gebied van Histon 3 bevindt, is het sterically minder toegankelijk in vergelijking met wijzigingen op de flexibele Histon staarten23. Om te begrijpen van de functie van H3K79 methylering, zijn betrouwbare en reproduceerbare analysemethoden ter bepaling van de locatie en de genomische omgeving nodig. In deze paper methoden presenteren wij isolatie methoden van verschillende neurale progenitoren (CPC voor de cortex) en CGNPs voor het cerebellum, effectieve DOT1L remmer behandeling en een ChIP-methode voor het analyseren van methylation van H3K79 via qPCR of rangschikken op ander moment punten tijdens corticale en Cerebellaire ontwikkeling. Voor een overzicht van het protocol en de mogelijkheden, Zie Figuur 1.

Protocol

Dierenwelzijn commissies van de Universiteit van Freiburg en de plaatselijke instanties goedgekeurd alle dierproeven (G12/13, G16/11) vermeld in het volgende protocol. 1. voorbereiding Voorbereiding van de CPC’s isolatie Instellen getimede paring om te verkrijgen van embryo’s in de verschillende stadia van ontwikkeling van de cortex (tussen E11.5 en E14.5). Gebruik de muizen van de stam NMRI (Naval Medical Research Institute), die ten minste 8 oud weken. N…

Representative Results

Opzet van neurale voorlopercellen isolatie, teelt, H3K79me2 ChIP en ChIP analysemethoden: Figuur 1 toont een stroomdiagram voor het uitvoeren van H3K79me2 ChIP van corticale voorlopercellen op verschillende tijdstippen tijdens de embryonale hersenontwikkeling of cerebellaire granulaire neuron progenitoren in postnatale stadia. Als een eerste stap, de hersenen moet worden geïsoleerd en de telencephalon (tussen E11.5 en E14.5) of het cerebellu…

Discussion

Er zijn twee belangrijke manieren voor het uitvoeren van de chromatine immunoprecipitation om te ontdekken de genomic bezetting van Histon modificaties, transcriptiefactoren, histone code lezers, schrijvers of gummen. Een is de inheemse ChIP methode met behulp van de nuclease verteerd, inheemse chromatine voor immunoprecipitation, en anderzijds de onderhavige methode met PFA-vaste, sheared chromatine, waarin de nucleosomes en andere DNA-ingeschrevenen eiwitten wijze aan het DNA covalente 39. nativ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Henriette Bertemes voor het helpen om het protocol van de teelt van CGN in het lab. Deze methode papier werd gesteund door de Medische epigenetica DFG-gefinancierde CRC992 door financiering van TV. De auteurs erkennen de steun van het Team van de Melkweg Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning en Prof. Rolf Backofen, bio-informatica, Universiteit van Freiburg, Duitsland gefinancierd door Collaborative Research Centrum 992 Medische epigenetica (DFG grant SFB 992/1-2012) en het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd subsidie 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

View Video