La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN
Summary
Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.
Abstract
Cassures double brin de l’ADN (DSB) sont de graves lésions de l’ADN. Analyse de la formation et la réparation d’ORD est pertinente dans un large éventail de domaines de recherche, y compris l’intégrité du génome, génotoxicité, radiobiologie, vieillissement, le cancer et le développement de médicaments. En réponse à l’ORD, l’histone H2AX est phosphorylé à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase formant discrètes foyers nucléaires détectables par microscopie d’immunofluorescence. En outre, 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine favorisant l’ORD importante favorisant la réparation de l’ORD par fin-joining non-homologues tout en empêchant la recombinaison homologue. Selon les fonctions spécifiques de γH2AX et 53BP1, l’analyse combinée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une approche raisonnable pour une analyse détaillée de l’ORD. Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape complété par des notes méthodiques pour effectuer la technique. Plus précisément, l’influence du cycle cellulaire sur les habitudes des foyers γH2AX est démontrée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. En outre, la valeur des foyers γH2AX comme biomarqueur est représentée dans les lymphocytes de radiographie irradié d’un individu sain. Enfin, instabilité génétique est étudiée dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë par microscopie d’immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.
Introduction
ADN est endommagé en permanence par endogène (par exemple, la réplication stress, espèces réactives de l’oxygène, l’instabilité intrinsèque de l’ADN) et exogènes (par exemple, des radicaux chimiques, irradiation) sources (Figure 1)1,2 ,3,4. Parmi les lésions de l’ADN, cassures double brin de l’ADN (DSB) sont particulièrement graves lésions et peuvent induire la mort cellulaire ou la carcinogenèse. Environ 50 ORD peut-être survenir par cellule et cycle cellulaire5. Dans les cellules de mammifères, la recombinaison (HR) et non-homologues fin-rejoindre (NHEJ) mis au point comme principales voies pour la réparation d’ORD (Figure 2). HR se produit à la fin de la phase S/G2 et utilise une sœur intacte chromatid comme gabarit pour réparation potentiellement exempt d’erreurs. En comparaison, NHEJ est active tout au long du cycle cellulaire et potentiellement mutagènes comme paires de bases peuvent être ajoutés ou réséqués avant la ligature de l’extrémité cassée. En outre, la fin alternative-rejoindre peut être engagé comme un mécanisme lent mutagènes réparation de secours en cas de carence NHEJ6,7.
DSB induit la phosphorylation de l’histone H2AX à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase autour de chaque ORD. Les foyers nucléaires formant sont nommées γH2AX foyers et sont détectés par immunofluorescence microscopie8. ΓH2AX favorise le recrutement des autres protéines sensibles à la DSB et participe au remodelage de la chromatine, la réparation de l’ADN et de transduction de signal9. Comme chaque accent γH2AX est considéré comme un simple ORD, la quantification de l’ORD par microscopie d’immunofluorescence est possible, ce qui a été démontrée dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons de patient10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine clé dans la médiation réparation ORD. Il est impliqué dans le recrutement de DSB-souples protéines, signalisation de point de contrôle et la synapse de DSB se termine15. En outre, 53BP1 joue un rôle essentiel dans le choix de voie de réparation ORD. Il déclenche la réparation d’ORD vers NHEJ, tandis que les RH sont empêchés16. Si l’on considère les véritables fonctions de γH2AX et 53BP1 dans la réparation de l’ORD, l’analyse simultanée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une méthode utile pour l’analyse précise de la formation et la réparation de l’ORD.
Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape pour l’exécution de la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des cellules. Plus précisément, la technique est appliquée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF, dans les lymphocytes de radiographie irradié d’une personne en bonne santé et dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë. Les détails de la méthode sont soulignées dans le contexte des résultats présentés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 est une méthode utile pour analyser la formation et la réparation de l’ORD dans un large éventail de domaines de recherche. Les paramètres essentiels qui influencent les résultats des expériences sont la phase du cycle cellulaire, les agents utilisés pour la fixation et la perméabilisation des cellules, le choix de l’anticorps et le matériel et les logiciels de la microscopie à fluorescence.
L’influence du cycle cellulaire…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet a été soutenu par la Fondation allemande José Carreras leucémie (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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