Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.
DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn ernstige DNA-beschadigingen. Analyse van de vorming en de reparatie van DSB is relevant in een breed spectrum van onderzoek op gebieden zoals genoom integriteit genotoxiciteit, straling biologie, veroudering, kanker en Geneesmiddelenontwikkeling. In reactie op DSB, is de Histon H2AX phosphorylated op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren vormen discrete nucleaire foci aantoonbaar door immunofluorescentie microscopie. Bovendien is 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een ander belangrijk DSB-responsieve eiwit bevordering van reparatie van DSB door nonhomologous einde-toe te treden terwijl het voorkomen van homologe recombinatie. Volgens de specifieke functies van γH2AX en 53BP1 kunnen de gecombineerde analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie een redelijke benadering voor een gedetailleerde analyse van DSB. Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol, aangevuld met methodische notities voor het uitvoeren van de techniek. Specifiek, blijkt de invloed van de celcyclus op γH2AX foci patronen in normale fibroblasten van de cellijn NHDF. Verder, is de waarde van de γH2AX foci een biomarker teljaren in x-ray bestraald lymfocyten bij een gezonde persoon. Tot slot wordt de genetische instabiliteit in CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie onderzocht door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.
DNA is permanent beschadigd door endogene (bv, replicatie stress, reactieve zuurstof soorten, intrinsieke instabiliteit van DNA) en exogene (bv, chemische radicalen, bestraling) bronnen (Figuur 1)1,2 ,3,4. Onder DNA schade, DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn bijzonder ernstige letsels en kunnen leiden tot celdood of carcinogenese. Ongeveer 50 DSB voordoen per cel en celcyclus5. Bij zoogdiercellen homologe recombinatie (HR) en nonhomologous eind-verbinden (NHEJ) ontwikkeld als belangrijke trajecten voor de reparatie van DSB (Figuur 2). HR treedt op in laat S/G2-fase en maakt gebruik van een intact zus chromatide als een sjabloon voor reparatie mogelijk vrij van fouten. Ter vergelijking: NHEJ is actief gedurende de celcyclus en potentieel mutagene zoals basenparen kunnen worden toegevoegd of gereseceerd voordat Afbinding van de gebroken uiteinden. Daarnaast mogen alternatieve einde-toetreding worden gebruikt als een langzame mutagene reparatie van de back-up mechanisme in geval van NHEJ deficiëntie6,7.
DSB induceren de fosforylering van de Histon H2AX op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren rond elke DSB. De vormende nucleaire foci heten γH2AX foci en door immunofluorescentie microscopie8worden opgespoord. ΓH2AX bevordert de aanwerving van verdere DSB-responsieve eiwitten en is betrokken bij de chromatine remodeling, reparatie van DNA en signaaltransductie9. Zoals elke γH2AX focus wordt beschouwd als een enkele DSB vertegenwoordigen, is de kwantificering van DSB door immunofluorescentie microscopie het mogelijk, dat is aangetoond in kanker cellijnen en patiënt exemplaren10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een andere belangrijke eiwit in het bemiddelen van DSB reparatie. Het is betrokken bij de aanwerving van DSB-responsieve eiwitten, checkpoint signalering en de synapsis van DSB uiteinden15. Daarnaast speelt 53BP1 een cruciale rol bij de keuze van DSB reparatie traject. Er wordt de reparatie van DSB richting NHEJ gegenereerd terwijl HR verhinderd16 is. Gelet op de daadwerkelijke functies van γH2AX en 53BP1 in DSB reparatie, de gelijktijdige analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie mogelijk een handige methode voor de nauwkeurige analyse van de vorming en de reparatie van DSB.
Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 in de celkernen. In het bijzonder wordt de techniek toegepast in normale fibroblasten voor de cellijn NHDF, x-ray bestraald lymfocyten van een gezond individu en CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie. De details van de methode zijn gewezen in het kader van de gepresenteerde resultaten.
Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 is een handige methode voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DSB in een breed spectrum van onderzoeksgebieden. Kritische parameters die invloed hebben op de resultaten van de experimenten zijn de fase van de celcyclus, de stoffen die worden gebruikt voor de fixatie en permeabilization van de cellen, de keuze van de antilichamen, en de hardware en software van de fluorescentie Microscoop.
De invloed van de celcyclus op γH2AX …
The authors have nothing to disclose.
Het project werd ondersteund door de Duitse José Carreras leukemie Stichting (DJCLS 14 R/2017).
RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
Cytospin device | |||
Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |