À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

Summary

Il s’agit d’un protocole de temps – et rapport coût – entrée en vitro étudie les mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblées, qui est un très besoin médical dans le traitement du cancer.

Abstract

Les deux dernières décennies ont vu un changement de médicaments cytotoxiques à une thérapie ciblée en oncologie médicale. Bien que les agents thérapeutiques ciblés ont montré une efficacité clinique plus impressionnante et réduit au minimum les effets négatifs que les traitements traditionnels, la résistance aux médicaments est devenu la principale limite à leurs prestations. Plusieurs modèles précliniques/in vitro/in vivo de la résistance acquise aux agents ciblés dans la pratique clinique ont été développés principalement à l’aide de deux stratégies : manipulation i) génétique pour la modélisation des génotypes de résistance acquise et ii) in vitro / in vivo sélection de modèles résistants. Dans le présent travail, nous proposons un cadre fédérateur, pour étudier les mécanismes sous-jacents responsables de la résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de faire taire les procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur. Cette approche simple de temps – et rapport coût – entrée est largement applicable et pourrait être facilement étendue pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments ciblés dans différentes tumeurs histotypes.

Introduction

Suite aux découvertes cruciales en biologie moléculaire et cellulaire, un certain nombre de nouvelles molécules anticancéreuses synthétisées ont été développé pour cibler sélectivement les voies de signalisation oncogènes dans un large éventail de types de tumeurs. En particulier, deux catégories d’agents thérapeutiques ciblés aux propriétés uniques en oncologie, des composés chimiques synthétiques à savoir et on sait que les anticorps monoclonaux recombinants, ont obtenu des succès cliniques et considérablement altérée du cancer dans ces dernières décennies^1,2,3.

Néanmoins, malgré leur impressionnante réponse initiale au traitement, la majorité des patients atteints de cancer ont développé la résistance à tous les agents thérapeutiques ciblées, les anticorps monoclonaux et inhibiteurs de la kinase. En conséquence, la résistance aux médicaments, l’obstacle majeur pour des médicaments anticancéreux classique⁴, est toujours un grand défi pour les nouvelles thérapies ciblées^5,6.

Résistance à la thérapie ciblée peut être intrinsèque (c’est-à-direprimaire) ou acquis (p. ex., secondaire). Résistance intrinsèque décrit un manque de novo de la réponse au traitement, tandis que la résistance secondaire survient après une période de réponse aux médicaments traitement⁷. Ce dernier est causé par des flambées de petites cohortes des cellules tumorales dans la majeure partie de la tumeur primitive ou niché dans des créneaux anatomiques cryptiques distales, présentant jusqu’à 90 % résistance à un ou plusieurs ciblées agents thérapeutiques. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent un développement de la résistance à la thérapie ciblée principalement résultent de mutations du gène cible et redondante activation d’autres voies de signalisation apoptotiques, dont la compréhension est encore loin d’être complet⁸.

Dans ce travail, nous avons proposé une approche temps – et rapport coût – entrée pour étudier in vitro des mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de réduire au silence procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur, un outil crucial pour tester et valider les hypothèses de travail. En particulier, notre approche a été utilisée pour étudier, dans le cancer gastrique, les mécanismes de résistance au trastuzumab (p. ex., Herceptine), un anticorps monoclonal humanisé ciblant le domaine extracellulaire de protéine HER2⁹. Trastuzumab + chimiothérapie est largement reconnue comme le traitement standard de première ligne du cancer du sein métastatique HER2-positif. Grâce à des études précliniques récentes montrant qu’anti-HER2 thérapies ont une activité significative dans les deux in vitro et in vivo de cancer gastrique HER2 positive modèles^10,11, médicaments moléculaires ciblant HER2 ont été largement étudié dans les essais cliniques, dont certains sont toujours en cours, sur des patients avec gastro cancer^12,13,14,15.

Ces études ont souligné le nombre croissant de patients souffrant de résistance au trastuzumab¹⁶, similaire à ce qui est observé d’autres inhibiteurs de thérapeutiques ciblées. En particulier, le taux de réponse de trastuzumab a été de 47 % et la médiane de survie globale pour les patients sous trastuzumab + chimiothérapie a été plus longues que pour les patients sous chimiothérapie seule¹⁷2,7 mois seulement. Ceci suggère que, tandis que la résistance primaire de trastuzumab est répandue, résistance secondaire trastuzumab est inévitable. Pour cette raison, il est urgent de clarifier les mécanismes causant la résistance de la thérapie ciblée HER2 dans le cancer gastrique, qui est encore plus problématique compte tenu de l’hétérogénéité génétique intra-tumorale de cette néoplasie¹⁸.

En outre, les mécanismes de résistance au trastuzumab dans le cancer gastrique ont prouvé difficiles à expliquer, partiellement en raison de la difficulté à obtenir des représentant des modèles précliniques fiable de cette condition. Oshima et coll. ont signalé une méthode de sélection in vivo de lignées cellulaires de cancer de l’estomac résistant au trastuzumab, consistant en une culture répétée d’une petite métastase péritonéale résiduelle après traitement par trastuzumab¹⁹. Toutefois, la nécessité d’un meuble, de l’expertise de gestion animale spécifique et de l’approbation du Comité d’éthique de l’Animal ont contribué à ce qui en fait une méthode de beaucoup de temps et de coût. L’approche que nous décrivons dans ce travail est simple et largement applicable et pourrait être facilement étendu pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments dans différentes tumeurs histotypes²⁰.

Protocol

Remarque : Ce protocole a été ajusté spécialement pour l’analyse des mécanismes qui sous-tendent la résistance acquise au trastuzumab de lignées de cellules de cancer gastrique HER-positive. Tous les instruments de laboratoire nécessaires figurent dans la Table des matières. 1. génération des sous-clones résistant à la thérapie ciblées NOTE : Ceci est la plus critique et difficile à normaliser pas dans le protocole dû au fait que …

Representative Results

La figure 1 donne un aperçu du cadre de la procédure expérimentale. Trois cancers gastriques lignées cellulaires exprimant un niveau élevé de HER2 et sensible au trastuzumab (IC50 < concentration plasmatique maximale du graphe de gauche de médicament, Figure 2 a,) ont été cultivées dans un milieu de culture contenant l’agent thérapeutique ciblée. Une dose a 10 fois inférieure à la concentration plasmati…

Discussion

Alors que personnalisé et ciblé des thérapies ont suscité l’enthousiasme croissant, ces thérapies dites « intelligentes » face à l’obstacle majeur même comme les médicaments de chimiothérapie traditionnelle, c’est-à-dire, l’acquisition rapide et imprévisible de la pharmacorésistance. Pour améliorer les résultats de la thérapie ciblée, des problèmes de résistance aux médicaments doivent être résolus par une meilleure compréhension des mécanismes qui les causent. Ici, nous avons pr…

Materials

Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection