ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

Summary

هذا الوقت–وفعالة من حيث التكلفة في المختبر بروتوكول تحقق آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، وحاجة طبية العالية التي لم تلب في إدارة السرطان.

Abstract

خلال العقدين الماضيين شهدت تحولاً من العقاقير السامة للخلايا للعلاج المستهدفة في الأورام السرطانية. على الرغم من أن العوامل العلاجية المستهدفة وأظهرت الفعالية السريرية أكثر إثارة للإعجاب، والآثار الضارة مصغر من العلاجات التقليدية، أصبحت المقاومة للعقاقير إلى القيد الرئيسي لفوائدها. تم تطوير عدة نماذج الإكلينيكية في المختبر/المجراة في المقاومة المكتسبة لوكلاء المستهدفة في الممارسة السريرية أساسا باستخدام استراتيجيتين: التلاعب ط) الوراثية للنمذجة الوراثية المقاومة المكتسبة، والثاني) في المختبر/ المجراة في اختيار النماذج مقاومة. في هذا العمل، فإننا نقترح إطارا موحدا، للتحقيق في الآليات الأساسية المسؤولة عن المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم لوصف إسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع. هذه المرة-وفعالة من حيث التكلفة نهج بسيط قابلاً للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى المستهدفة في هيستوتيبيس ورم مختلفة.

Introduction

متابعة الاكتشافات الهامة في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية، قد وضعت عددا من جزيئات السرطان تجميعي رواية لاستهداف مسارات إشارات النمطان في طائفة واسعة من أنواع الأورام بشكل انتقائي. على وجه الخصوص، المركبات الكيميائية الاصطناعية هي فئتين من العوامل العلاجية المستهدفة مع خصائص فريدة من نوعها في علم الأورام، والمعروف مونوكلونل المؤتلف، حققت نجاحات السريرية والرعاية سرطان غيرت جذريا في العقود الأخيرة^1،،من²³.

ومع ذلك، وضعت غالبية مرضى السرطان استجابتها الأولية مثيرة للإعجاب للعلاج، وعلى الرغم من مقاومة الأدوية لجميع العوامل العلاجية المستهدفة، كل من الأجسام المضادة ومثبطات كيناز. نتيجة لذلك، المقاومة للعقاقير، العقبة الرئيسية للأدوية المضادة للسرطان الكلاسيكية⁴، لا يزال يشكل تحديا كبيرا للناشئة العلاجات المستهدفة^5،6.

قد تكون مقاومة للعلاج المستهدفة الجوهرية (أيالابتدائية) أو مكتسبة (أي، الثانوية). يصف المقاومة المتأصلة حيثياته عدم الاستجابة للعلاج، بينما المقاومة الثانوي يحدث بعد فترة من استجابة للمخدرات العلاج⁷. بسبب تفشي أفواج صغيرة من الخلايا السرطانية داخل الجزء الأكبر الورم بدائية أو تقع في منافذ التشريحية خفي القاصي والعارضة تصل إلى 90% مقاومة لواحد أو أكثر يستهدف العوامل العلاجية. الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مقاومة للعلاج المستهدفة أساسا نتيجة لطفرات الجينات المستهدفة وتفعيل مسارات الإشارات الأخرى الموالية البقاء على قيد الحياة، التفاهم الذي لا يزال بعيداً عن كامل⁸زائدة عن الحاجة.

واقترحنا في هذا العمل، نهجاً الوقت–وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في المختبر آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم للأدوية إلى وصف لإسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع، أداة حاسمة المستخدمة للاختبار والتحقق من صحة فرضيات العمل. على وجه الخصوص، استخدمت نهجنا للتحقيق، في الإصابة بسرطان المعدة، آليات المقاومة تراستوزوماب (مثلاً، هيرسيبتين)، جسم [مونوكلونل] أنسنة استهداف المجال خارج الخلية ل بروتين HER2⁹. تراستوزوماب + العلاج الكيميائي مقبول على نطاق واسع كعلاج الخط الأول القياسية لسرطان الثدي المنتشر إيجابية HER2. بفضل الدراسات السريرية الحديثة تبين أن مكافحة-HER2 العلاجات لها نشاط كبير في على حد سواء في المختبر و في فيفو سرطان المعدة إيجابية HER2 نماذج^10،11، كانت العقاقير الجزيئية استهداف HER2 درس على نطاق واسع في التجارب السريرية، التي لا تزال جارية، في المرضى الذين يعانون من السرطان المعدي^12،13،،من¹⁴¹⁵.

وأكدت هذه الدراسات ارتفاع عدد المرضى التي تواجه مقاومة تراستوزوماب¹⁶، على نحو مماثل لما يتم ملاحظته لمثبطات العلاجية المستهدفة الأخرى. على وجه الخصوص، كان معدل الاستجابة من تراستوزوماب 47 في المائة، ومتوسط بقاء الشاملة للمرضى على العلاج الكيميائي + تراستوزوماب أطول من المرضى على العلاج الكيميائي وحدها¹⁷2.7 شهرا فقط. هذا يشير إلى أن المقاومة تراستوزوماب الابتدائي منتشر، لكن المقاومة تراستوزوماب الثانوي أمر لا مفر منه. لهذا السبب، هناك حاجة ملحة توضيح الآليات التي تسبب مقاومة العلاج المستهدفة HER2 في الإصابة بسرطان المعدة، وحتى أكثر صعوبة نظراً لعدم تجانس الوراثية داخل مداواة هذا نيوبلسا¹⁸.

وبالإضافة إلى ذلك، أثبتت آليات المقاومة إلى تراستوزوماب في سرطان المعدة صعبة أن يفسر، جزئيا بسبب صعوبة الحصول على نماذج موثوقة السريرية الممثل لهذا الشرط. أوشيما وآخرون عن أسلوب انتقاء في فيفو من خطوط الخلايا تراستوزوماب مقاومة سرطان المعدة، تتكون ثقافة المتكررة خبيث البريتوني الصغيرة المتبقية بعد العلاج مع تراستوزوماب¹⁹. ومع ذلك، ساهمت الحاجة من ضميمة وخبرات محددة في التعامل مع الحيوانات، وموافقة “لجنة الأخلاقيات الحيوان” يجعلها أسلوب استهلاكاً لوقت وتكلفة. النهج الذي يصف لنا في هذا العمل بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى في ورم مختلفة هيستوتيبيس²⁰.

Protocol

ملاحظة: عدلت هذا البروتوكول لتحليل الآليات الكامنة وراء المقاومة المكتسبة إلى تراستوزوماب هير المصابات بسرطان المعدة خلية خطوط على وجه التحديد. وترد في الجدول للموادجميع الصكوك المختبرية اللازمة. 1-جيل سوبكلونيس مقاومة للعلاج المستهدف ملاحظة: هذا ه…

Representative Results

الشكل 1 يبين الإطار الداخلي التجريبية. ثلاثة سرطان المعدة خلية خطوط التعبير عن مستوى عال من HER2 وحساسة إلى تراستوزوماب (IC50 < مستوى البلازما الذروة من المخدرات، الشكل 2 ألف، الرسم البياني الأيسر) كانت تزرع في الثقافة المتوسطة التي تحتو?…

Discussion

بينما شخصية واستهدفت العلاجات أثارت الحماس المتزايد، تواجه هذه العلاجات ما يسمى ‘الذكية’ العقبة الرئيسية نفسها كالمخدرات العلاج الكيميائي التقليدي، أي، واكتساب المقاومة للأدوية سريعة ولا يمكن التنبؤ بها. لتحسين نتائج العلاج المستهدفة، يجب أن تحل مشاكل مقاومة العقاقير من خلال فهم أ…

Materials

Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection