Мы описываем метод количественного определения агрегации смятых протеинов. Наши детали протокола лентивирусные индуцированной стабильной клеток линии поколение, автоматизированных конфокальная томография и анализа изображений белка агрегатов. Как наглядные приложения мы изучали влияние малых молекул в продвижении SOD1 агрегата в зависимости от времени и дозы.
Боковой амиотрофический склероз (ALS) является смертельным нейродегенеративных заболеваний, которые могут быть вызваны унаследованные мутации в гене кодирования медно цинковой супероксиддисмутаза 1 (SOD1). Структурная нестабильность SOD1 и обнаружение включений SOD1-позитивных больных семейная ALS поддерживает потенциальных причинную роль Протеолиз и/или агрегированных SOD1 ALS патологии. В этом исследовании мы описывают развитие на основе ячеек пробирного, разработанный высоким содержанием скрининг подходы для количественного определения динамики SOD1 агрегации в живых клетках. С помощью лентивирусные векторы, мы создали стабильных клеточных линий, выражая одичал типа и мутантов А4в SOD1 отмеченных желтый флуоресцентный белок и обнаружил, что оба белки были выражены в цитозоле без каких-либо признаков агрегации. Интересно только SOD1 А4в стабильно выражена в ГЭС-293, но не в U2OS или SH-SY5Y клеточных линий, сформированы агрегаты на лечение ингибитором протеасом. Мы покажем, что это возможно для количественного определения агрегации, основанные на анализе различных ингибиторов протеасом доза реакция, а также отслеживать агрегат формирование кинетики, покадровой микроскопии. Наш подход предусматривает возможность количественной оценки эффект мутаций ALS на роль SOD1 в совокупных формирования, а также скрининга для малых молекул, которые мешают SOD1 А4в агрегации.
Агрегации белков является биологический процесс, в котором денатурации белков группа вверх и может выступать в качестве возбудителей в нейродегенеративных заболеваний (амилоидоз). Характеризующие агрегации белка имеет важное значение в понимании роли агрегатов в клеточных дисфункции, также как и облегчение открытия новых факторов, которые влияют наступления патологии. Визуализация с тегами флуоресценции белков в живых клетках это мощный метод, который может помочь в развитии анализов, применимые к высоким содержанием скрининг (HCS)1,2,3,4.
Боковой амиотрофический склероз (ALS) рассматривается как proteopathic заболевания, вызванные наличием смятых протеинов с склонность к совокупности и накапливаются в двигательных нейронов в семье ALS (Фалс) и спорадические ALS (Салс)5,6 . Подмножество ~ 20% фалс случаев связаны с доминирующим мутации в гене кодирования цитозольной антиоксидантной фермента супероксиддисмутаза медно цинковой типа 17,(SOD1)8. Было предложено несколько возможных причин для этого генетически производных дисфункции, включая изменения в структуре и функции SOD1 вариантов, например аберрантных стабильности, увеличилась скорость развертки и склонность к совокупного9, 10. Примечательно свойство только проверенные и потенциально токсичных разделяют оба варианта связаны ALS SOD1 и SOD1 (WT) одичал тип является увеличение склонности агрегатов разобщенным белка или белковых включений11,12 . Протеолиз мутант SOD1, неизменно является polyubiquitinated и деградируют убиквитин протеасом системой. В результате низкий уровень ингибирование протеасом активности приводит к накоплению мутант, SOD1 объединяет13,14, какие формы аморфные структуры состоят из растворимых компонентов, которые могут обмениваться с растворимых мутант SOD1 в цитозоль15. В частности, SOD1 мутант А4в (аланина в кодон 4 изменено на валин) является наиболее распространенным ALS-вызывая мутации и приводит к быстрой нейродегенеративные с средний выживания время менее 2 лет после начала заболевания16. Биохимически SOD1 А4в имеет склонностях к monomerize, агрегировать и формируют амилоида поры; его поры, как агрегатов аналогичны амилоида поры других заболеваний, связанных мутантных форм, например α-synuclein и β-амилоида белка17. Для изучения динамики накопления SOD1-агрегат, методы мониторинга растворимых и нерастворимых SOD1 статистические формы по-прежнему разрабатываться.
Мы ранее показали, с использованием клеток и клеток ГЭС-293 временно transfected с флуоресцентный протеин тегами SOD1, ALS-связанные мутации ухудшить SOD1 димеризации и агрегации11. Хотя системы переходных выражения может дать полезную информацию о биологических результаты краткосрочных гиперэкспрессия генов, методы, обеспечивая стабильную интеграцию желаемого генов может быть предпочтительным для анализа развития. Таким образом лентивирусные векторы предлагают возможность придать экспрессии генов долгосрочный и регулируемых на клетки млекопитающих 18. В этом исследовании мы сосредоточены на создание стабильных клеточных линий, преобразованы с рекомбинантным человека, учитывая WT и мутант SOD1 отмеченных желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Использование изображений микроскопия живой клетки и автоматизированных количественной оценки SOD1 агрегации, мы вызвали и количественно SOD1 агрегации событий на ингибирование протеасом.
Существует два основных подхода для создания стабильных клеточных линий. Первый занимает несколько недель и требует переходных transfection и сопротивления выбор векторов геномной интегрированной плазмида ДНК. Второй занимает всего несколько часов с помощью Лентивирусы, что делает этот п?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантов, финансируемая правительством Кореи (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) и Национальный фонд исследований Кореи (NRF) программы поддержки индивидуальных ученый (СР 2013M3A9B5076486/СР 2015R1D1A1A09057239).
ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |