Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aggregation fehlgefaltete Proteine. Unsere Protokolldetails Lentivirale induzierte stabile Zellgeneration Linie, automatisierte konfokale Bildverarbeitung und Bildanalyse von Proteinaggregaten. Als anschauliche Anwendung haben wir untersucht die Wirkung kleiner Moleküle bei der Förderung der SOD1-Aggregation in einer Zeit und Dosis-abhängigen Weise.
Abstract
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine tödliche Neurodegenerative Erkrankung, die durch vererbte Mutationen im gen Kodierung Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) verursacht werden können. Die strukturelle Instabilität des SOD1 und die Erkennung von SOD1-positiver Einschlüsse in familiärer ALS-Patienten unterstützt eine mögliche ursächliche Rolle für fehlgefaltete und/oder aggregierte SOD1 ALS Pathologie. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung eines zellbasierte Assays entwickelt, um die Dynamik der SOD1-Aggregation in lebenden Zellen zu quantifizieren durch hohen Gehalt screening Ansätze. Mit Lentivirale Vektoren, erzielten wir stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck Wildtyp und Mutanten A4V SOD1 getaggt mit gelb fluoreszierende Protein und festgestellt, dass beide Proteine im Cytosol ohne Anzeichen einer Aggregation zum Ausdruck gebracht wurden. Interessanterweise nur SOD1 A4V stabil ausgedrückt in HEK-293, aber nicht in U2OS oder SH-SY5Y Zelllinien gebildet Aggregate Proteasom-Inhibitor Behandlung. Wir zeigen, dass es möglich ist, basierend auf Dosis-Wirkungs-Analyse der verschiedenen Proteasom-Inhibitoren Aggregation zu quantifizieren und Aggregat-Formation Kinetik von Time-Lapse Mikroskopie zu verfolgen. Unser Ansatz stellt die Möglichkeit der Quantifizierung des Effekts ALS Mutationen auf die Rolle des SOD1 in Aggregatbildung sowie screening für kleine Moleküle, die SOD1 A4V Aggregation verhindern.
Introduction
Proteinaggregation ist ein biologischer Prozess, durch den misfolded Proteine Gruppe auf und kann als Erreger bei neurodegenerativen Erkrankungen (Amyloidose) handeln. Charakterisierung von Proteinaggregation ist unerlässlich für das Verständnis der Rolle von Aggregaten in zellulären Dysfunktion ebenso wie bei die Entdeckung der neuen Faktoren, die Einfluss auf den Beginn der Pathologie, zu erleichtern. Die Visualisierung der Fluoreszenz-markierten Proteine in lebenden Zellen ist eine leistungsfähige Methode, die bei der Entwicklung von Assays für high Content screening (HCS)1,2,3,4unterstützen kann.
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) gilt als eine Proteopathic Erkrankung, die durch die Anwesenheit von fehlgefaltete Proteine mit der Neigung zu aggregieren und reichern sich in motorischen Neuronen in familiäre ALS (fALS) und sporadisch ALS (sALS)5,6 . Eine Teilmenge von ~ 20 % der Fälle fALS sind verbunden mit dominanten Mutationen im gen Kodierung der cytosolischen antioxidative Enzym Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase Typ 1 (SOD1)7,8. Mehrere mögliche Ursachen für diese genetisch abgeleiteten Dysfunktion sind vorgeschlagen worden, einschließlich Änderungen in der Struktur und Funktion des SOD1-Varianten, z. B. abweichende Stabilität erhöhte sich entfaltenden Rate und Neigung zur aggregierten9, 10. Vor allem, die einzige geprüfte und potentiell toxische Eigenschaft geteilt durch beide ALS verknüpft SOD1-Varianten und Wildtyp (WT) SOD1 ist eine erhöhte Neigung zu unterteilte Proteinaggregaten oder proteinhaltige Einschlüsse11,12 . Fehlgefaltete mutierte SOD1, ist beharrlich Polyubiquitinated und durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Infolgedessen führt ein niedriges Niveau der Hemmung der Proteasom-Aktivität zur Anhäufung von mutierte SOD113,14, aggregiert die amorphe Strukturen der löslichen Komponenten zusammengesetzt, die mit löslichen mutierte SOD1 austauschen können in der Zellflüssigkeit15. In bestimmten, SOD1 Mutanten A4V (Alanin am Codon 4 geändert, Valin) ist die am häufigsten ALS verursachende Mutation und führt zu schnellen Neurodegeneration mit eine durchschnittliche Überlebenszeit von weniger als 2 Jahre nach Krankheit Beginn16. Biochemisch, hat SOD1 A4V eine zunehmende Tendenz zu monomerize, zu aggregieren und zu bilden Amyloide Poren; die Pore-ähnliche Aggregate sind ähnlich wie Amyloid Poren der anderen Krankheit verbunden mutierten Formen, wie z. B. α-Synuclein und β-Amyloid-Protein17. Um die Dynamik des SOD1-Aggregat Anhäufung zu studieren, noch Methoden zur Überwachung von löslicher und unlöslicher SOD1 zusammengefasster Forms entwickelt werden.
Wir haben bereits gezeigt, mit live Cell Imaging und HEK-293-Zellen transfiziert vorübergehend mit fluoreszierenden Protein-Tags SOD1, dass ALS-assoziierten Mutationen SOD1 Dimerisierung und Aggregation11beeinträchtigt. Obwohl transiente Expressionssysteme nützliche Informationen über den biologischen Ausgang des kurzfristigen gen Überexpression bereitstellen können, können Methoden, die eine stabile Integration der gewünschten Gene für Assay-Entwicklung vorzuziehen. Als solche bieten Lentivirale Vektoren die Möglichkeit, langfristige und regulierten Genexpression auf Säugerzellen 18verleihen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von stabilen Zelllinien mit rekombinanten Lentivirus Lager WT ausgestrahlt und mutierten SOD1 getaggt mit gelben fluoreszierenden Proteins (YFP). Mit live Cell imaging Mikroskopie und automatisierte Quantifizierung der SOD1-Aggregation, wir ausgelöst und quantifiziert SOD1-Aggregation-Veranstaltungen bei der Hemmung des Proteasoms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei Hauptansätze zur Erzeugung von stabilen Zelllinien. Die erste dauert mehrere Wochen und erfordert eine transiente Transfektion und Widerstand Auswahl der genomischen integriertes Plasmid DNA-Vektoren. Die zweite ist eine Sache von Stunden durch den Einsatz von Lentivirus, dieses Protokoll in mehreren Zelllinien mit geringem Aufwand für den Ausdruck des Zielproteins zugänglich machen. Die Reise-CMV-Vektor-19 war ein nachhaltiges Vektor mit konservierten Transduktion Effizienz und st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) und der National Research Foundation of Korea (NRF) einzelnen Wissenschaftler Förderprogramm (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) finanziert.
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
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