Здесь мы представляем это протокол на основе микроскопии высокого разрешения изображений и трехмерной реконструкции мыши блок нервно-сосудистого и blood – brain барьер мозга свободно плавающего секций. Этот метод позволяет для визуализации, анализа и количественной оценки внутриклеточных органелл в BBB.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — это динамический многоклеточных интерфейс, который регулирует транспорт молекул между распространением и мозг. Трансцитоз через BBB регулирует доставку гормонов, метаболитов и терапевтических антител к паренхимы мозга. Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе иммунофлюоресценции свободно плавающего секций с лазерного сканирования конфокальная микроскопия и анализ изображений для визуализации внутриклеточных органелл в эндотелиальных клеток на уровне BBB. Сочетание этого набора данных с 3D изображений программное обеспечение для анализа позволяет для полуавтоматических сегментации и количественной оценки капиллярного объема и площади поверхности, а также числа и интенсивности внутриклеточных органелл в BBB. Чтобы проиллюстрировать метод используется обнаружение мыши эндогенного иммуноглобулина (IgG) в пределах внутриклеточных везикулы и их количественная оценка на уровне BBB. Этот протокол потенциально могут применяться к исследованию механизмов, контролирующих BBB Трансцитоз различных молекул в естественных условиях.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является непрерывной сотовой барьер формируется астроциты, pericytes, нейроны и эндотелиальных клеток, отделяющий центральной нервной системы (ЦНС) от циркуляции крови1. Правила транспорта через BBB играет решающую роль в поддержании гомеостаза головного мозга и опосредовано специализированные свойства эндотелиальных клеток мозга (ящики). Присутствие плотные межклеточные соединения между ящики и низкий уровень базальной Трансцитоз ограничить перевозки кровь молекул, соответственно2в параклеточный и transcellular. Недавно Трансцитоз путь в ящики были использованы для улучшения доставки терапевтического больших молекул до мозга3,4. Однако механизмы Трансцитоз через BBB еще не были полностью характеризуется5,6.
Была проделана обширная работа в vitro расшифровать молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих внутриклеточного транспорта через ящики7,8,9,10, 11, но таких систем не повторить сложные архитектуры и физиологии нервно-сосудистого подразделения (NVU). С другой стороны исследования в vivo12,13 представить подробную количественную информацию о транспортных ставок через BBB, но не обеспечивают понимание внутриклеточных механизмов транспорта. Таким образом расследование сотовой и внутриклеточных компонентов NVU in vivo и ex vivo остается весьма сложной14. Только ограниченное количество методов для анализа внутриклеточных структур внутри клетки NVU. Большинство исследований использования электронной микроскопии, но эта техника ограничивается сложные протоколы, необходимые для подготовки надлежащего ткани и пробами. Таким образом мы создали методологию, основанную на конфокальная микроскопия высокого разрешения, которая облегчит обработку образцов мозга, анализа и количественной оценки субцеллюлярные отсеков в ячейках NVU.
Здесь мы описываем протокол, который использует свободно плавающего секции мозга мыши для выполнения количественных изображений BBB и NVU на клеточном и субклеточном уровнях. Мы протестировали и проверить количество антител к изображения и реконструировать NVU в трех измерениях. Кроме того этот протокол позволяет изображений на Максимальное оптическое разрешение дифракционный органелл в пределах капилляров мозга. Вместе с анализа изображений этот протокол может использоваться для изучения внутриклеточного транспорта макромолекул через BBB в различных экспериментальных условиях, например в мыши нейродегенеративные болезни модели.
Протокол, изложенные выше описывается подготовка мозга свободно плавающего секций, immunofluorescent окрашивание, захвата изображений и анализа параметров для высокого разрешения микроскопии BBB. Расследовать локализации антитела доставки платформы3, транспорт эндогенных IgG через BBB17и неоднородность BBB по перицит потери18недавно использовался этот метод. Различные шаги в протоколе могут быть изменены для адаптации к конкретной цели эксперимента. Во-первых использование толстые разделов (100 мкм) облегчает их обработки во время процедуры иммуноокрашивания и монтаж. Она также позволяет для 3D-реконструкции капиллярной сети, блок нервно-сосудистого и для поколения капилляров и сечения NVU. Однако проникновение антител в разделах ткани могут различаться и некоторые Пятнать антитела могут быть ограничены в поверхностный слой ткани, недалеко от coverslip. Протокол может быть изменен путем увеличения концентрации моющего средства на этапе permeabilization и/или длина permeabilization шагом для улучшения антитела проникновения в ткани. Во-вторых качество изображения может быть нарушена при попытке получить изображения глубже в ткани (обычно 20-30 мкм ниже поверхности) из-за рассеяния света, а также оптические аберрации от преломления несоответствие. Для преодоления этой проблемы, новые методы для очистки тканей и активные антитела проникновения20 может сочетаться с настоящим Протоколом для изображения больших объемов ткани. В-третьих деконволюции выполняется после захвата изображений для повышения осевой разрешение изображения. Выбор алгоритма слепой Деконволюция, используемые в настоящем протоколе был основан на (i) ее простота в использовании, как не предварительный расчет точки распространения функция требуется, (ii) его надежности для улучшения качества изображения21и (iii) отсутствие артефактов на mIgG внутриклеточные структуры после осуществления. В зависимости от внутриклеточных структур, визуализируется в образце другие алгоритмы деконволюция может привести к более высокое качество изображения. Следующие ссылки21,22 обеспечивают широкое обсуждение на преимущества и ограничения дополнительных алгоритмов для изображения деконволюции. Наконец использование пакет программного обеспечения анализа изображений допускается сегментации капилляров и внутриклеточных структур в трех измерениях. Явно анализ изображений не ограничивается программное обеспечение, описанное в протокол и альтернативных пакетов, например те, которые обсуждаются в ссылку23, может использоваться для сегмента изображения. Пригодности различных программ для анализа внутриклеточных структур через BBB должны быть проверены эмпирически оценки точности сегментации изображений.
Поскольку этот метод основан на фиксированных выборок, он не предоставляет прямую информацию о динамике Трансцитоз через BBB. Однако она может сочетаться с24-курс экспериментов, например внутривенно инъекционных молекулы интерес и оценки его накопления в ящики в разных временных точках после инъекции, чтобы реконструировать кинетика внутриклеточный транспорт. Преимуществом этого подхода является, что он позволяет для анализа глубоких мозга регионов, как показано в18, в которой в настоящее время недоступны для прижизненной визуализации живой подходов. Важнейшим шагом в ходе протокол является тщательный контроль фиксации ткани. Фиксация с 4% PFA резко уменьшает иммуногенности внутриклеточных органелл и эндогенного или периферийно управляемых иммуноглобулины17 (рис. 1B). Ограничением данного протокола является его требование высокого качества антител (то есть, низкий неспецифичный пятнать, низкий перекрестной реактивности) подходит для иммунофлюоресценции. Условии, что такие реагенты доступны, метод может применяться для расследования внутриклеточной локализации любого протеина интереса. Например протокол использовался для выявления лизосом в эндотелиальных клеток мозга17. Следует также отметить, что, поскольку этот протокол основан на confocal микроскопии, латеральное разрешение ограничены дифракцией и не удается разрешить структур меньше приблизительно 175 до 250 Нм (рис. 2).
Предыдущие исследования провели подробный анализ клеточного состава нервно-сосудистого блока с помощью конфокальной микроскопии25,26. Однако расследование внутриклеточного транспорта на уровне BBB опирается главным образом на использование передачи электронной микроскопии19,27,28. Хотя этот метод предлагает высокое разрешение боковых внутриклеточных структур, электронной микроскопии остается сложной техники с низкой пропускной способностью. Кроме того количество различных молекулярных целей, которые могут быть визуализированы EM является весьма ограниченным. Этот протокол предлагает альтернативу доступной расследовать внутриклеточного транспорта на уровне BBB. Полная процедура, от мозга коллекции для анализа изображений, может быть выполнена в 5-6 дней. Если имеются подходящие антитела, иммунофлюоресценции позволяет одновременное обнаружение нескольких клеток типы/молекул в пределах того же образца. Кроме того этот протокол может сочетаться с суперразрешением микроскопии методов для преодоления ограничений в пространственное разрешение29. В целом описанные выше протокол позволяет количественная оценка изменения внутриклеточной локализации протеинов интереса в блоке нервно-сосудистых. Его применение для различных генетических или фармакологических возмущений позволит расследовать внутриклеточные структуры и транспортные функции BBB в естественных условиях.
The authors have nothing to disclose.
Работа р.в. был поддержан Roche докторантура стипендий (2014-2017 годы).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |