여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.
혈액-뇌 장벽 (BBB) 순환과 두뇌 사이 분자의 수송을 조절 하는 동적 다세포 인터페이스입니다. BBB 걸쳐 Transcytosis 뇌 실질에 호르몬, 대사, 그리고 치료 항 체의 납품을 통제 한다. 여기, 선물이 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 시각화 subcellular 세포 BBB에서 내 피 세포 내에서 면역 형광 검사 무료-부동 섹션의 결합 하는 프로토콜. 이 데이터 집합을 결합 하 여 3D 이미지 분석 소프트웨어와 함께 반자동된 세분화 및 모 세관 볼륨의 정량화 표면 영역으로 개수와 BBB에서 세포내 세포의 강도 대 한 수 있습니다. 세포내 소포 및 그들의 정량화는 BBB에서 내 마우스 생 면역 글로불린 (IgG)의 검출 방법을 설명 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 다른 분자 비보의 BBB transcytosis를 제어 하는 메커니즘의 수사에 적용할 수 있습니다.
혈액-뇌 장벽 (BBB) 연속 세포 장벽입니다 이다, pericytes, 신경 세포, 내 피 세포에 의해 형성 된 혈액 순환1에서 중앙 신경 조직 (CNS)를 분리 하는. BBB에 걸쳐 교통 규제 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할을 담당 하 고 뇌 내 피 세포 (BECs)의 특수 속성에 의해 중재. BECs transcytosis의 낮은 기초 율 사이 꽉 세포 접합의 존재의 혈액을 매개로 분자, 각각2paracellular 및 transcellular 전송을 제한 합니다. 최근, transcytosis 통로 BECs에 뇌3,4치료 큰 분자의 납품을 강화 밝혀 되었습니다 있다. 그러나, BBB에 걸쳐 transcytosis 메커니즘 아직 되지 않은 완전히 특징이5,6.
광범위 한 작업에서 체 외에서 세포 및 분자 메커니즘 BECs7,,89,10, 를 통해 세포내 전송 규제를 해독 완료 되었습니다 11, 하지만 이러한 시스템 복잡 한 건축과 혈관 단위 (NVU)의 생리학 정리 하지. 다른 한편으로, 학문 vivo에서12,13 BBB에서 전송 속도에 상세한 양적 정보를 제공 하지만 전송의 세포내 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 NVU의 세포와 세포내 구성 요소 조사 vivo에서 ex vivo 남아 있다 매우 도전적인14. 기술의 제한 된 수만 세포는 NVU의 subcellular 구조를 분석 하는 의무가 있습니다. 대부분의 연구는 전자 현미경 검사 법을 사용 하지만이 기술은 적절 한 조직 준비 및 샘플 처리에 필요한 복잡 한 프로토콜에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 뇌 샘플의 처리, 분석, 그리고는 NVU의 세포 내 subcellular 구획의 정량화를 촉진 것이 높은 해상도 confocal 현미경 기반 방법론 설립.
여기, 우리는 BBB와 세포 및 subcellular 수준의 NVU의 양적 이미징 수행을 마우스 뇌 부동성 섹션을 이용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 테스트 하 고 이미지와 3 차원에서 NVU 재구성에 항 체의 수를 확인. 또한,이 프로토콜 뇌 모세 혈관 내에서 세포의 최대 광학 회절 제한 된 해상도 이미지를 수 있습니다. 이미지 분석, 함께 neurodegeneration의 마우스 질병 모델에 예를 들어 다른 실험 조건 하에서 BBB에서 고분자의 세포내 수송을 조사 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
위에서 설명한 프로토콜 BBB의 고해상도 현미경 뇌 부동성 섹션, immunofluorescent 얼룩, 이미지 수집 및 분석 매개 변수의 준비를 설명 합니다. 이 방법은 최근 항 체 전달 플랫폼3, BBB17에서 내 생 적인 IgG의 교통과 pericyte 손실18시 BBB의 이종의 지역화를 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 프로토콜의 다른 단계는 실험의 특정 목표에 맞게 수정할 수 있습니다. 첫째, 두께 (100 µ m) 단면도 사용 하 여 immunostaining 및 설치 절차 동안 그들의 처리를 촉진 한다. 그것은 또한 모 세관 네트워크 neurovascular 단위의 3 차원 재구성 및 모 세관 및 NVU 횡단면의 세대에 대 한 수 있습니다. 그러나, 조직 섹션 내에서 항 체의 다를 수 있습니다 그리고 일부 항 체 얼룩이 지는 coverslip 주변 조직의 표면 층을 제한할 수 있습니다. 프로토콜은 permeabilization 단계 동안 세제의 농도 또는 permeabilization 단계 조직으로 항 체 침투 개선의 길이 증가 하 여 수정할 수 있습니다. 둘째, 이미지 품질 이미지 산란으로 굴절율 불일치에서 광학 착오 인 조직 (표면 아래 일반적으로 20 ~ 30 μ m) 내의 깊은 시도할 때 손상 될 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 삭제 하는 조직과 활성 항 체 침투20 에 대 한 새로운 방법이이 프로토콜 조직의 이미지 더 큰 볼륨을 함께 결합할 수 있습니다. 셋째, deconvolution 축 해상도의 이미지를 개선 하기 위해 이미지 수집 후 수행 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 장 님 deconvolution 알고리즘의 선택은 (i) 그것의 사용의 용이성, 포인트 확산 함수의 아무 사전 계산은이 기반 필요, 이미지 품질21, 그리고 (iii) mIgG에의 부족을 개선 하기 위한 (ii) 그것의 견고성 구현 후 세포내 구조입니다. 세포내 구조 샘플에 시각에 따라 다른 deconvolution 알고리즘 높은 이미지 품질에서 발생할 수 있습니다. 다음 참조21,22 장점과 이미지 deconvolution 추가 알고리즘의 한계에 대 한 광범위 한 토론을 제공 합니다. 마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 3 개 차원에서 모세 혈관과 세포내 구조의 세분화를 허용. 명확 하 게 이미지 분석 프로토콜 및 대체 패키지 참조23에서 설명 하는 예 하에 설명 하는 소프트웨어를 제한 하지 않습니다, 그리고 세그먼트 이미지를 사용할 수 있습니다. 이미지 세분화의 정확도 평가 하 여 BBB 통해 세포내 구조 분석에 대 한 다른 소프트웨어 프로그램의 적합성을 실험적으로 확인 되어야 한다.
이 메서드는 고정 된 샘플에 기반을, 그것은 BBB에 걸쳐 transcytosis의 역학에 대 한 직접적인 정보를 제공 하지 않습니다. 그러나, 그것은 결합 될 수 있다 시간 과정 실험24, 예를 들어 정 맥 주입의 분자 재구성의 활동을 주입 후 다른 시간 지점에서 BECs 내의 그것의 축적을 측정 하 여 세포내 수송입니다. 이 방법의 장점은18, 현재 intravital 라이브 이미징 접근에 액세스할 수 있는 같이 깊은 두뇌 지구의 분석에 대 한 허용 한다. 프로토콜 중 중요 한 단계는 조직 고정의 주의 깊은 모니터링. 고정 4 %PFA 극적으로 세포내 세포와 생 또는 주변 관리 면역 글로불린17 (그림 1B)의 immunogenicity 감소 시킨다. 이 프로토콜의 한계의 요구-고품질 항 체의 (즉, 낮은 일반적인 얼룩, 낮은 분) 면역 형광 검사에 적합 이다. 같은 시 약을 사용할 수를 제공 관심사의 어떤 단백질의 세포내 지역화 조사 메서드를 적용할 수 있습니다. 예를 들어 프로토콜 뇌 내 피 세포17리소좀을 식별 하기 위해 사용 되었다. 이 프로토콜은 confocal 현미경 검사 법에 기반을, 측면 해상도 회절에 의해 제한 됩니다을 약 175 ~ 250 보다 작은 구조를 확인할 수 없는도 주목 한다 nm (그림 2).
이전 연구는 confocal 현미경 검사 법25,26를 사용 하 여 혈관 단위의 세포 구성의 상세한 분석을 수행 했습니다. 그러나, 전송 전자 현미경 검사 법19,,2728의 사용에 주로 의존 BBB에서 세포내 수송을 조사 합니다. 이 메서드는 세포내 구조의 높은 측면 해상도 제공 합니다, 전자 현미경 낮은 처리량을 가진 도전적인 기술 남아 있다. 또한, EM에 의해 구상 될 수 있는 다른 분자 대상의 수는 매우 제한 됩니다. 이 프로토콜 BBB에서 세포내 수송을 조사 하는 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 5 ~ 6 일에 이미지 분석, 뇌 컬렉션에서 완전 한 절차를 수행할 수 있습니다. 적합 한 항 체를 사용할 수 있는 경우 면역 형광 같은 샘플 내의 여러 세포 유형/분자의 동시 탐지를 허용 한다. 또한이 프로토콜 공간 해상도29에 한계를 극복 하기 위해 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술로 결합 될 수 있었다. 전반적으로, 위에서 설명한 프로토콜 변화 neurovascular 단위 내의 관심사의 단백질의 세포내 지역화에 정량화를 수 있습니다. 다른 유전자 또는 약리학 물결에 대 한 응용 프로그램 비보에BBB의 세포내 구조 및 전송 기능을 조사 하는 수 있게 됩니다.
The authors have nothing to disclose.
캠핑카 작업 로슈 박사 친목 (2014-2017)에 의해 지원 되었다.
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |