O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.
O ensaio de metástase pulmonar (PuMA) é um ex vivo explante de pulmão e o sistema de cultura de célula fechada que permite aos pesquisadores estudar a biologia da colonização de pulmão no osteossarcoma (OS) por microscopia de fluorescência. Este artigo fornece uma descrição detalhada do protocolo e discute exemplos de obtenção de dados de imagem em crescimento metastático usando widefield ou plataformas de microscopia de fluorescência confocal. A flexibilidade do modelo PuMA permite que os pesquisadores a estudar não só o crescimento de células do sistema operacional no microambiente do pulmão, mas também para avaliar os efeitos da terapêutica antimetastático ao longo do tempo. Microscopia confocal permite sem precedentes, de alta resolução de imagem de interações de celular so com o parênquima pulmonar. Além disso, quando o modelo de PuMA é combinado com corantes fluorescentes ou repórteres genética de proteína fluorescente, pesquisadores podem estudar o microambiente pulmonar, estruturas celulares e subcelulares, função do gene e atividade de promotor em células metastáticas do sistema operacional. O modelo da PuMA oferece uma nova ferramenta para investigadores de osteossarcoma descobrir a nova biologia metástase e avaliar a atividade da novela terapias anti metastáticas, direcionadas.
Melhorado os resultados para pacientes pediátricos com metástase osteossarcoma (OS) continua a ser uma necessidade crítica de clínicas atendidas 1. Isto ressalta a importância do desenvolvimento de novas terapias de alvo molecular. Chemotherapeutics convencional que a proliferação de células de tumor alvo não provaram para ser eficazes no tratamento da doença metastática e, assim, novas estratégias deve direcionar o próprio processo metastático 2. O atual artigo aborda os aspectos práticos de um tipo relativamente novo de ex vivo modelo metástase do pulmão, o ensaio de metástase pulmonar (PuMA) desenvolvido por Mendoza e colegas3, que fornece uma ferramenta útil na descoberta de novos motoristas moleculares em progressão de metástases pulmonares em OS 4,5. Antes de prosseguir, no entanto, seria prudente tocar brevemente sobre vários modelos atuais de metástase, e como o modelo da PuMA oferece diversas vantagens sobre os convencionais em vitro ensaios.
Modelos mais experimentais usados para estudar a metástase é composto por sistemas in vitro e in vivo que recapitular uma etapa específica ou várias etapas da cascata metastática. Estas etapas incluem: células de tumor 1) migrando longe o tumor primário, 2) intravasation em navios nas proximidades (sangue ou linfático) e trânsito na circulação, 3) prender no site secundário, 4) extravasamento e sobrevivência no local secundário, formação de 5) de micrometastases e 6) crescimento em metástases vascularizados (Figura 1). Modelos in vitro de metástase podem incluir a migração de 2-dimensional (2D) e 3-dimensional (3D) Matrigel invasão os ensaios que são revisados em detalham em outro lugar 6. Para os modelos na vivo , os dois sistemas modelo comumente usados incluem: 1) o modelo espontâneo de metástase é onde um células tumorais são orthotopically injetado em um tipo específico de tecido para formar um tumor local que derrama espontaneamente células metastáticas para locais distantes; 2) o modelo experimental de metástase é onde as células do tumor são injetadas para o vaso sanguíneo montante do órgão alvo. Por exemplo, uma injeção veia cauda dos resultados de células de tumor no pulmão do desenvolvimento metástases5,7,8. Outros modelos experimentais metástase incluem injeção de células de tumor no baço ou veia mesentérica, que resulta no desenvolvimento de metástases hepáticas9,10. Considerações práticas desses modelos na vivo são discutidas em detalhe por Welch 11. Outro modelo na vivo costumava estudar metástase em sarcomas pediátricos é o modelo de implantação de tumor subcapsular renal rim que resulta na formação de tumor local e metástases espontânea para os pulmões 12,13. Uma técnica mais tecnicamente exigente como tele-microscopia intravital pode visualizar diretamente, em tempo real, as interações entre as células do câncer metastático e a microvasculatura de um site metastático (ie. pulmão ou fígado) conforme descrito por MacDonald14 e Entenberg15, ou extravasamento de células de câncer na membrana corioalantoicas como descrito por Kim 16.
O modelo de PuMA é um ex vivo, explante de tecido do pulmão, sistema de cultura fechado onde o crescimento de células tumorais fluorescentes pode ser longitudinalmente observado através de microscopia de fluorescência durante um período de um mês (ver Figura 2A). Este modelo recapitula os estágios iniciais de colonização de pulmão (passos 3 a 5) na cascata metastática. Algumas vantagens principais do modelo PuMA sobre modelos convencionais em vitro são: 1) fornece uma oportunidade para medir o crescimento de células de câncer metastático em um microambiente 3D que mantém muitas características do microambiente do pulmão longitudinalmente em vivo 3; 2) puMA permite ao pesquisador avaliar se a derrubada de um tratamento de gene ou drogas de candidato tem atividade antimetastática no contexto de um microambiente pulmonar 3D; 3) o modelo de PuMA é flexível, com vários tipos de plataformas de microscopia fluorescência (Figura 2B) tais como a microscopia de fluorescência widefield ou microscopia confocal de varredura a laser, exemplos de cada um são mostrados na Figura 2 & D, respectivamente. Este artigo irá discutir como usar o modelo de PuMA para obter dados de imagem longitudinais sobre o crescimento metastático da proteína verde fluorescente melhorada (eGFP)-expressar, células humanas osteossarcoma de alto e baixo metastático (MNNG e HOS células, respectivamente) usando baixa ampliação widefield fluorescência. Exemplos de imagens, uma tintura fluorescente que rotula o parênquima pulmonar e uma proteína fluorescente vermelha repórter genética que rotula as mitocôndrias no so células no modelo PuMA usando microscopia confocal de varredura a laser também são discutidos.
O seguinte artigo técnico descreve alguns aspectos práticos do modelo PuMA em estudar a colonização de pulmão no sistema operacional. Alguns passos críticos no protocolo onde pesquisadores devem tomar cuidado extra incluem o seguinte:
a) canulação da traqueia. A traqueia pode ser facilmente danificada enquanto dissecando o circundante do músculo e do tecido conjuntivo. Além disso, a agulha do cateter pode facilmente ser empurrada através da traqueia. Preste atenção a como o bisel …
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer o Dr. Arnulfo Mendoza que forneceu treinamento na técnica de PuMA. Além disso, gostaríamos de reconhecer os Drs Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) e Sam Aparicio (BC Cancer Agency) para fornecer o uso de seus microscópios no decorrer deste estudo. Esta pesquisa foi apoiada (em parte) pelo programa de pesquisa Intramural de institutos nacionais de saúde, centro de pesquisa de câncer, filial de oncologia pediátrica. M.M.L. foi apoiado pelo programa nacional de institutos de saúde Intramural visitando Fellow (prêmio 15335) e atualmente é suportado por Joan Parker doutorado em pesquisa de metástase. EP é suportado pelo British Columbia Cancer Foundation.
Table 2 | |||
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3 | |||
Materials for PuMA | |||
Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 4 | |||
Surgical instruments for PuMA | |||
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |