Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom
Summary
Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.
Abstract
De pulmonaire metastase assay (PuMA) is een ex vivo Long explant en gesloten celcultuur waarmee onderzoekers om te bestuderen van de biologie van longkanker kolonisatie in Osteosarcoom (OS) door fluorescentie microscopie. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het protocol, en voorbeelden van het verkrijgen van afbeeldingsgegevens op metastatische groei met widefield of confocal fluorescentie microscopie platformen. De flexibiliteit van het model van de PuMA toelaat onderzoekers bestuderen van niet alleen de groei van OS cellen in de longen-communicatie, maar ook voor het beoordelen van de effecten van anti-metastatische therapeutics na verloop van tijd. Confocale microscopie zorgt voor ongekende, high-resolution beeldvorming van OS cel interacties met de Long parenchym. Bovendien, wanneer de PuMA model wordt gecombineerd met fluorescente kleurstoffen of TL proteïne genetische verslaggevers, onderzoekers kunnen bestuderen de Long-communicatie, cellulaire en subcellular structuren, genfunctie en promotor activiteit in uitgezaaide cellen van het OS. De PuMA-model biedt een nieuw hulpmiddel voor Osteosarcoom onderzoekers om te ontdekken van nieuwe metastase biologie en de activiteiten beoordelen van nieuwe anti-gemetastaseerd, gerichte therapieën.
Introduction
Verbeterde resultaten voor pediatrische patiënten met metastatische Osteosarcoom (OS) blijft een kritische unmet klinische behoefte 1. Dit onderstreept het belang van de ontwikkeling van nieuwe moleculair-gerichte therapieën. Conventionele chemotherapeutica dat doel tumor celproliferatie hebben niet bewezen effectief bij de behandeling van uitgezaaide ziekte, en zo nieuwe strategieën moeten richten op het metastatische proces zelf 2. Het huidige artikel behandelt de praktische aspecten van een relatief nieuw soort ex vivo Long metastase model, de pulmonaire metastase assay (PuMA) ontwikkeld door Mendoza en collega’s3, waarmee een nuttig instrument in het ontdekken van nieuwe moleculaire bestuurders in Long metastase progressie in OS 4,5. Voordat u verdergaat, echter, zou het verstandig zijn kort ingaan op de verschillende huidige modellen van metastase, en hoe de PuMA model biedt diverse voordelen ten opzichte van conventionele in vitro testen.
Meest experimentele modellen gebruikt bij het bestuderen van metastase bestaan uit in vitro en in vivo systemen die een specifieke handeling of verschillende stappen van de metastatische cascade recapituleren. Deze stappen omvatten: 1) de tumorcellen migreren uit de buurt van de primaire tumor, 2) intravasation in nabijgelegen vaartuigen (bloed- of lymfestelsel) en doorvoer in omloop, 3) arresteren op het secundaire site, de 4) extravasation en de overleving op de secundaire site, 5) vorming micrometastasen, en 6) groei in gevacuoliseerd metastasen (Figuur 1). In vitro modellen van metastase 2-dimensionale (2D) migratie kunnen opnemen en 3-dimensionale (3D) Matrigel invasie testen die zijn herzien in detail elders 6. Voor in vivo modellen, de twee meest gebruikte modelsystemen omvatten: 1) de spontane metastase model is waarbij een tumorcellen orthotopically geïnjecteerd in een specifieke weefseltype te vormen van een lokale tumor die spontaan uitgezaaide cellen werpt naar verre locaties; 2) het experimentele metastase model is waar tumorcellen worden ingespoten in het bloedvat stroomopwaarts van de doel-orgel. Bijvoorbeeld, een staart veneuze injectie van tumor cellen leidt tot de ontwikkeling Long metastasen5,7,8. Andere experimentele metastase modellen zijn injectie van tumorcellen in de milt of lymfklieren ader wat in de ontwikkeling van lever metastasen9,10 resulteert. Praktische overwegingen van deze in vivo modellen worden in detail besproken door Welch 11. Een andere in vivo model gebruikt bij het bestuderen van metastase in pediatrische sarcomen is het renale nier subcapsular tumor implantatie model, wat in de vorming van lokale tumor en spontane metastase voor de longen 12,13 resulteert. Een meer technisch veeleisende techniek zoals intravital videomicroscopy kan direct visualiseren, in real-time, interacties tussen metastatische kankercellen en de microvasculature van een metastatische site (dwz. longen of lever) zoals beschreven door MacDonald14 en Entenberg15, of kanker cel extravasation in het chorion membraan zoals beschreven door Kim, 16.
De PuMA-model is een ex vivo, Long weefsel explant, gesloten cultuur systeem waar de groei van fluorescerende tumorcellen lengterichting waarneembaar via fluorescentie microscopie gedurende een periode van een maand (Zie figuur 2A). Dit model recapituleert de aanvankelijke stadia van longkanker kolonisatie (stappen 3 tot en met 5) in de gemetastaseerde cascade. Enkele belangrijke voordelen van de PuMA model ten opzichte van conventionele in vitro modellen zijn: 1) het biedt een kans om de lengterichting meten metastatische kanker-celgroei in een 3D communicatie die heeft veel kenmerken van de Long communicatie behouden vivo 3; 2) puMA kan de onderzoeker om te beoordelen of het knockdown van een kandidaat-gen of drug behandeling anti-metastatische activiteit in het kader van een 3D Long communicatie heeft; 3) de PuMA model is flexibel met vele soorten fluorescentie microscopie platforms (figuur 2B) zoals widefield fluorescentie microscopie of laser-scanning confocal microscopie, worden voorbeelden van elk weergegeven in figuur 2C & O, respectievelijk. Dit artikel zal bespreken hoe de PuMA model kunt verkrijgen van longitudinale imaging gegevens over de metastatische groei van verbeterde groen fluorescent proteïne (eGFP)-uiten, menselijke hoge en lage metastatische Osteosarcoom cellen (cellen met MNNG en HOS, respectievelijk) met behulp van lage-vergroting widefield fluorescentie. Voorbeelden van imaging een fluorescente kleurstof waarmee de Long parenchym de labels, en een rood-fluorescerende eiwit genetische verslaggever waarmee labels mitochondriën in OS cellen in het model van de PuMA met behulp van confocale laser scanning microscopie worden ook besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het volgende technische artikel beschrijft enkele praktische aspecten van het model van de PuMA in het bestuderen van de Long kolonisatie in OS. Sommige kritische stappen in het protocol waar onderzoekers extra zorg moeten omvatten het volgende:
a) cannulation van de luchtpijp. De luchtpijp kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens het ontleden van de omliggende spier- en bindweefsel. De naald van de katheter kan bovendien eenvoudig worden geduwd door de luchtpijp. Aandacht besteden aan hoe de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Dr. Arnulfo Mendoza die opleiding in de techniek van PuMA. Daarnaast willen we Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), en Sam Aparicio (BC Cancer Agency) erkennen voor het gebruik van hun microscopen verstrekken in de loop van deze studie. Dit onderzoek werd (gedeeltelijk) ondersteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Institutes of Health, Center for Cancer Research, pediatrische oncologie tak. M.M.L. werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid intramurale bezoeken collega-programma (award 15335), en wordt momenteel ondersteund door een Joan Parker Fellowship in metastase onderzoek. P.H.S. wordt ondersteund door British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
