Grande Volume, iluminação comportamentalmente relevantes para Optogenetics em primatas não-humanos
Summary
Um protocolo para construir um iluminador penetrante de tecido para entregar a luz sobre grandes volumes com diâmetro mínimo é apresentado.
Abstract
Este protocolo descreve um iluminador de grande volume, que foi desenvolvido para manipulações de optogenetic do cérebro de primatas não humanos. O iluminador é uma fibra óptica de plástico modificada com ponta gravada, tal que a área de superfície de emissores de luz é > 100 x de uma fibra convencional. Além de descrever a construção do iluminador de grande volume, este protocolo detalha a calibração de controle de qualidade usada para assegurar a distribuição de luz mesmo. Além disso, este protocolo descreve técnicas para inserir e retirar o iluminador de grande volume. Estruturas superficiais e profundas podem ser iluminadas. Este iluminador de grande volume não precisa ser fisicamente acoplado a um eletrodo, e porque o iluminador é feito de plástico, vidro, não, ele simplesmente se curvará em circunstâncias quando destruía tradicionais fibras ópticas. Porque este iluminador oferece luz sobre volumes de tecido comportamentalmente relevantes (≈ 10 mm3) sem dano de penetração maior do que uma fibra óptica convencional, ele facilita estudos comportamentais usando optogenetics em primatas não-humanos.
Introduction
Ferramentas de Optogenetic, que permitem controle neuronal milissegundo de precisão, luz-driven são amplamente utilizadas para estudar a fisiologia funcional e comportamento em roedores e invertebrados. No entanto, os desafios técnicos limitaram-se a utilização de optogenetics no cérebro de primatas não humanos, que tem um volume de ~ 100 x maior do que o cérebro de roedor 1.
Para facilitar estudos de optogenetics em primatas não-humanos, um iluminador foi projetado para atender a dois objetivos concorrentes: iluminação de grande volume e dano mínimo de penetração. Tentativas anteriores de endereço dentre estas preocupações vir no cara do outro. Feixes de fibras iluminar volumes maiores, mas com diâmetro maior e, assim, danos2,3. Fibras de vidro cônico reduzem danos de penetração, mas por pouco o foco de luz emitindo áreas de superfície < 100 µm2 4,5. Iluminação externa do cérebro através de uma janela na dura-máter contorna o desafio dos danos de penetração e pode permitir a iluminação de grande volume, mas ele só pode ser usado para algumas áreas de cérebro superficial6.
Para criar um iluminador de grande volume, pequeno diâmetro (Figura 1a), a ponta de um plástico óptico de fibra é calor afilado e o núcleo e o revestimento são gravadas (Figura 1bc). Ao contrário de outras fibras afiladas que focam a luz para um ponto estreito, a gravura permite que a luz uniformemente escapar para fora dos lados da ponta, assim, distribuir luz amplamente sobre uma grande área (Figura 1 de). Porque o dano de penetração é proporcional ao diâmetro de penetração, este iluminador não tem nenhum dano de penetração mais do que uma fibra convencional, ainda tem > 100 x a luz emitindo luz superfície de área e oferece mais amplamente com 1/100 o poder da luz densidade em um cérebro fantasma (1,75% do agarose) (Figura 1e). Um modelo de Monte Carlo (Figura 1f) ilustra a diferença na propagação de luz entre uma fibra convencional e o iluminador de grande volume, quando eles têm densidades de energia de luz igual como sua superfícies de emissores de luz. Cada iluminador é calibrado individualmente usando uma esfera de Ulbricht (Figura 2a, b) para assegurar a distribuição de luz até ao longo da ponta (Figura 2C).
Este iluminador de grande volume foi validado com manipulação de optogenetic de comportamento e de disparo neuronal em primatas não-humanos. O comprimento da ponta de fibra pode ser personalizado para qualquer área do cérebro e mapa de campo receptivo individual de cada animal. O iluminador pode ser emparelhado com um eletrodo penetrante para gravações neuronais que abrangem o período de iluminação. Além disso, porque a fibra pode carregar qualquer cor de luz visível, pode ser emparelhado com qualquer das moléculas optogenetic disponível disponíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto optogenetic ferramentas são amplamente utilizadas para estudar a doença e fisiologia em roedores, o desafio técnico de volumes de cérebro grande iluminante limitou o uso de optogenetics em primatas não-humanos. Pioneira estudos em macacos usadas densidades de grande poder de luz (~ 100 mW/mm2 a 20 W/mm2) para iluminar a volumes pequenos, talvez < 1 mm3e relatados efeitos comportamentais modestos com opsins excitatórios no córtex4, <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA reconhece o financiamento de uma bolsa NDSEG, a NSF GRFP e os amigos do Instituto McGovern. EP reconhece financiamento o Harry e Eunice Nohara UROP fundo, o MIT, turma de 1995 UROP fundo e fundo UROP MIT. ESB reconhece financiamento do NIH 2R44NS070453-03A1, o prêmio Harvey de deixar e o prêmio de fundação-Robertson NY células-tronco. RD reconhece financiamento de NIH EY017292. Michael Williams ajudou a equipe a organizar e recolher suprimentos antes da filmagem.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
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