Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani
Summary
Un protocollo per costruire un illuminatore penetrante di tessuto per fornire luce attraverso grandi volumi con diametro minimo è presentato.
Abstract
Questo protocollo descrive un illuminatore di grande volume, che è stato sviluppato per le manipolazioni di optogenetica nel cervello primate non umano. L’illuminatore è una fibra ottica di plastica modificata con punta acidato, tale che la superficie di uscita della luce è > 100 volte quella di una fibra convenzionale. Oltre a descrivere la costruzione dell’illuminatore a grandi volumi, questo protocollo dettaglia la taratura del controllo di qualità utilizzata per garantire la distribuzione uniforme della luce. Inoltre, questo protocollo descrive le tecniche per inserimento e rimozione dell’illuminatore di grande volume. Strutture superficiali e profonde possono essere illuminate. Questo illuminatore di grande volume non ha bisogno di essere fisicamente accoppiato ad un elettrodo, e perché l’illuminatore è fatta di plastica, non di vetro, esso semplicemente si piegherà a circostanze quando fibre ottiche tradizionali avrebbe distrutto. Perché questo illuminatore trasporta la luce sopra volumi rilevanti relativamente al comportamento del tessuto (≈ 10 mm3) con nessun danno una maggiore penetrazione di una fibra ottica convenzionale, esso facilita studi comportamentali utilizzando optogenetica in primati non umani.
Introduction
Strumenti di optogenetica, che consentono un controllo preciso al millisecondo, luce-driven neuronale sono ampiamente utilizzati per lo studio funzionale fisiologia e comportamento nei roditori e invertebrati. Tuttavia, le sfide tecniche hanno limitato l’uso di optogenetica nel cervello primate non umano, che ha un volume ~ 100 volte più grandi del cervello del roditore 1.
Per facilitare gli studi optogenetica in primati non umani, un illuminatore è stato progettato per affrontare due obiettivi contrastanti: illuminazione di grande volume e penetrazione minima danni. Precedenti tentativi di affrontare uno di questi problemi sono venuti presso il costoso di altro. Fasci di fibre per illuminare grandi volumi, ma con diametro maggiorato e, quindi, danno2,3. Fibre di vetro conico riducono danni di penetrazione, ma stretto fuoco luce alla luce che emettono superfici < 100 µm2 4,5. Illuminazione esterna del cervello attraverso una finestra nella dura elude la sfida di danni di penetrazione e può consentire per l’illuminazione di grande volume, ma può essere utilizzato solo per qualche superficiale cervello zone6.
Per creare un illuminatore di grandi volumi, di piccolo diametro (Figura 1a), la punta di plastica ottico della fibra è calore affusolato e il nucleo e il rivestimento sono incisi (Figura 1bc). A differenza di altre fibre conici che focalizzare la luce in un punto stretto, l’acquaforte permette alla luce di sfuggire uniformemente fuori i lati della punta, così, distribuendo in linea di massima luce su una vasta area (Figura 1 de). Perché danno di penetrazione è proporzionale al diametro di penetrazione, questo illuminatore non ha nessun più danni di penetrazione di una fibra convenzionale, eppure ha > 100 x la luce che emettono luce superficie area e trasporta più largamente con 1/100th il potere della luce densità in un cervello fantasma (1,75% agarosio) (Figura 1e). Un modello Montecarlo (Figura 1f) viene illustrata la differenza nella diffusione della luce tra una fibra convenzionale e l’illuminatore di grande volume hanno densità uguale potenza luce come loro superfici di uscita della luce. Ogni illuminatore è calibrato individualmente utilizzando una sfera integratrice (Figura 2a, b) per garantire una distribuzione uniforme della luce lungo la punta (Figura 2C).
Questo illuminatore di grande volume è stato convalidato con optogenetica manipolazione di comportamento e di firing neuronale in primati non umani. Lunghezza della punta della fibra può essere personalizzata a qualsiasi area del cervello e alla mappa del campo recettivo individuali di ogni animale. L’illuminatore può essere accoppiato con un elettrodo penetrante per le registrazioni di un neurone che si estendono la durata di illuminazione. Inoltre, poiché la fibra può trasportare qualsiasi colore della luce visibile, può essere accoppiato con qualsiasi delle molecole optogenetica disponibile disponibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre optogenetica strumenti sono ampiamente utilizzati per studiare la malattia e della fisiologia nei roditori, la sfida tecnica di volumi di grandi dimensioni del cervello illuminante ha limitato l’uso di optogenetica in primati non umani. Studi nelle scimmie pionieristici utilizzato densità di grande potenza della luce (~ 100 mW/mm2 a 20 W/mm2) per illuminare piccoli volumi, forse < 1 mm3e segnalati effetti comportamentali modesti con opsine eccitatorie in corteccia<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA riconosce finanziamenti da una compagnia NDSEG, il GRFP NSF e gli amici dell’Istituto McGovern. EP riconosce finanziamenti l’Harry ed Eunice Nohara UROP Fund, la classe del MIT del 1995 UROP fondo e sul fondo di UROP MIT. ESB riconosce finanziamenti dal NIH 2R44NS070453-03A1, il premio di Harvey di IET e il Premio Fondazione-Robertson della cellula formativa di New York. RD riconosce finanziamenti dal NIH EY017292. Michael Williams ha aiutato il team a organizzare e raccogliere le forniture prima delle riprese.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
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