Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica
Summary
Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.
Abstract
La meta terapéutica para la enfermedad arterial periférica y enfermedad isquémica del corazón es incrementar el flujo sanguíneo a áreas isquémicas causada por estenosis hemodinámica. Cirugía vascular es una opción viable en casos seleccionados, pero para los pacientes sin indicaciones para la cirugía como progresión para descanso dolor, isquemia crítica de miembros o importantes trastornos a la vida y de trabajo, hay pocas posibilidades para mitigar su enfermedad. Terapia celular mediante perfusión mejorada de monocitos a través de la estimulación de la formación de colaterales es uno de unas opciones no invasivas.
Nuestro grupo estudia Arteriogénesis después del trasplante del monocito en ratones utilizando el modelo de isquemia del miembro posterior. Previamente, hemos demostrado mejora en la perfusión de miembro posterior mediante trasplante de monocito syngeneic estimulado por el tétanos. Además de los efectos en la formación de colaterales, el crecimiento del tumor puede verse afectado por esta terapia así. Para investigar estos efectos, utilizamos un modelo de ratón de la matriz de la membrana del sótano-como mediante la inyección de la matriz extracelular del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm en el flanco del ratón, después de la obstrucción de la arteria femoral.
Después de los estudios del tumor artificial, utilizamos microscopía intravital en vivo tumor angiogénesis y monocitos autoguiado hacia el blanco dentro de arterias colaterales. Estudios previos han descrito la examinación histológica de los modelos animales, que presupone el análisis subsecuente post mortem los artefactos. Nuestro enfoque visualiza homing de monocitos a las áreas de colateralización en secuencias de tiempo real, es fácil de realizar e investiga el proceso de la Arteriogénesis y tumor angiogénesis in vivo.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares, como cardiopatía coronaria o enfermedad arterial periférica, son las causas más comunes de muerte a nivel mundial1. La terapia celular es un enfoque prometedor para tratar la enfermedad cardiovascular, especialmente para las personas que no son capaces de someterse a intervenciones quirúrgicas. Existen varios enfoques para utilizar células o sus sustancias secretadas como una herramienta terapéutica2,3, con el objetivo general de mejorar la perfusión y mantener la función del tejido isquémico y underperfused. Un intento de lograr este objetivo es mejorar la Arteriogénesis, que mejora el desarrollo de arterias colaterales. Los monocitos son un tipo de célula importante asociado con colateralización. Nuestro grupo se ha centrado en investigar los efectos de monocitos en las áreas de inflamación4,5, en particular utilizando el modelo de isquemia del miembro posterior para inducir isquemia y subsecuente inflamación6. Monocitos hogar de áreas de la inflamación y causan respuestas sistémicas complejas que conducen al desarrollo de colateralización7.
Con el uso de la microscopia intravital, podemos estudiar el comportamiento de estas células en vivo y observar el homing de monocitos inyectados a las áreas de inflamación. Mayoría de los estudios anterior sólo describe análisis de post mortem , que desventajas incluyendo una introducción de artefactos histológicos y gran número de animales necesarios para las preparaciones. Con nuestro enfoque, podemos investigar procesos inmunológicos y formación de colaterales a través de viva imagen en múltiples puntos del tiempo.
Además el desarrollo de arterias colaterales en áreas isquémicas, monocitos también influyen en el crecimiento del tumor. Para investigar estos procesos, inyectar una matriz de la membrana del sótano-como extraída el sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm, un tumor rico en matriz extracelular proteínas8y analizar mediante microscopía intravital. Esta matriz se utiliza para las moléculas de la pantalla de prueba para la formación de redes de células endoteliales o terapias contra el cáncer mediante la inhibición de angiogénicos; en este caso, evaluamos el potencial angiogénico de tumor de monocitos para celular terapia9,10,11.
El objetivo de este protocolo es demostrar de una manera fácil y eficiente para estudiar procesos inmunológicos causados por isquemia en un modelo en vivo . Podemos generar un entorno de prueba más realista en comparación con el workup histológico de tejido post mortem del músculo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método aquí descrito arroja luz sobre el desarrollo de arterias colaterales, el comportamiento de los monocitos en estos vasos y el proceso de la Arteriogénesis. Los pasos para la aplicación de este protocolo son fáciles de aprender y puede ser utilizado en otros campos de la ciencia. A pesar de estas ventajas, existen algunas desventajas. Por ejemplo, equipo microscópico es necesario para ejecutar las técnicas descritas. Obtener equipos para un experimento es insostenible, por lo que es importante colaborar co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el ELSE-Kröner-Stiftung y el DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de investigación colaborativa). Agradecimiento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Alemania, para el soporte técnico.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
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