Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte
Summary
Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.
Abstract
Het therapeutisch doel voor perifere arteriële ziekte en ischemische hartziekten is te verhogen van de bloedtoevoer naar ischemische gebieden veroorzaakt door hemodynamische stenose. Vasculaire chirurgie is een haalbare optie in bepaalde gevallen, maar voor patiënten zonder indicaties voor chirurgie zoals progressie te rusten pijn, kritische ledemaat ischemie of belangrijke verstoringen te leven of te werken, zijn er weinig mogelijkheden voor het beperken van hun ziekte. Celtherapie via monocyt-verbeterd door het stimuleren van de vorming van de collaterale perfusie behoort tot een paar niet-invasieve opties.
Onze fractie onderzoekt arteriogenesis na monocyt transplantatie in muizen met behulp van het stuk ischemie model. Eerder, hebben we verbetering in stuk perfusie met behulp van tetanus-gestimuleerd syngeneic monocyt transplantatie aangetoond. Naast de effecten op de bijkomende vorming, kan tumorgroei worden beïnvloed door deze therapie ook. Om te onderzoeken van deze effecten, gebruiken we een muismodel kelder membraan-achtige matrix door het injecteren van de extracellulaire matrix van de Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoom in de flank van de muis, na occlusie van de femorale slagader.
Na de studie van kunstmatige tumor, gebruiken we intravital microscopie in vivo tumor-angiogenese en monocyt homing binnen collateral slagaders te studeren. Eerdere studies hebben het histopathologisch onderzoek van diermodellen, hetgeen inhoudt latere analyse post mortem artefacten dat beschreven. Onze aanpak visualiseert monocyt homing naar gebieden van zekerheidsstelling in real-time sequenties, is gemakkelijk uit te voeren, en onderzoekt het proces van arteriogenesis en tumor angiogenese in vivo.
Introduction
Cardiovasculaire ziekten, zoals hart-en vaatziekten of perifere arteriële ziekte, zijn de meest voorkomende doodsoorzaken wereldwijd1. Celtherapie is een veelbelovende aanpak voor de behandeling van hart-en vaatziekten, met name voor mensen die niet kunnen ondergaan chirurgische ingrepen. Er zijn verschillende benaderingen cellen of hun secreted stoffen wilt gebruiken als een therapeutisch instrument2,3, met het einddoel voor verbetering van de perfusie en onderhouden van de functie van ischemische en underperfused weefsel. Een poging om dit doel te bereiken is het verbeteren van de arteriogenesis, die de ontwikkeling van collateral slagaders verbetert. Monocyten zijn een belangrijke celtype zekerheidsstelling is gekoppeld. Onze fractie heeft zich gericht op het onderzoeken van de effecten van monocyten in gebieden van ontsteking4,5, met name met behulp van het stuk ischemie model voor het opwekken van ischemie en latere ontsteking6. Monocyten thuis naar gebieden van ontsteking en complexe systemische reacties, die tot de ontwikkeling van zekerheidsstelling7 leidenveroorzaken.
Met het gebruik van intravital microscopie, kunnen we bestuderen het gedrag van deze cellen in vivo en observeren de homing van ingespoten monocyten naar gebieden van ontsteking. Meeste voormalige studies beschrijven alleen post-mortem analyse, die in het bezit van nadelen met inbegrip van een inleiding histologische artefacten en grote aantallen dieren vereist voor preparaten. Met onze aanpak, we kunnen onderzoeken immunologische processen en bijkomende vorming via live beeldvorming op meerdere tijdstippen.
Naast de ontwikkeling van collateral slagaders in ischemische gebieden invloed monocyten ook op tumorgroei. Om te onderzoeken van deze processen, we een matrix van de kelder membraan-achtige gewonnen uit de Engelbreth-Holm-Swarm muis Sarcoom, een tumor die rijk is aan de extracellulaire matrix eiwitten8, injecteren en analyseren met intravital microscopie. Deze matrix wordt gebruikt voor screentest moleculen voor endothelial celvorming netwerk of anti-kanker therapieën door inhibitie van de angiogenic; in dit geval zullen wij beoordelen de tumor angiogenic potentieel van monocyten voor cel therapie9,10,11.
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een gemakkelijke en efficiënte manier om immunologische processen veroorzaakt door ischemie in een in vivo -model te bestuderen. We kunnen genereren een meer realistische testomgeving t.o.v. histologische workup van post-mortem spierweefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode werpt licht op de ontwikkeling van collateral slagaders, het gedrag van monocyten in deze vaartuigen, en het proces van arteriogenesis. De stappen voor de toepassing van dit protocol zijn gemakkelijk te leren en kan worden gebruikt op andere terreinen van de wetenschap. Ondanks deze voordelen zijn er sommige nadelen. Bijvoorbeeld, is microscopische apparatuur vereist voor het uitvoeren van de beschreven technieken. Verkrijgen van apparatuur voor een experiment is onhoudbaar, dus is het belangri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de ELSE-Kröner-Stiftung en de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Duits Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, samenwerkend onderzoekscentrum). Speciale dank aan Hans-Holger Gärtner Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke Universiteit Magdeburg, Magdeburg, Duitsland, voor technische ondersteuning.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
