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Medicine

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

Published: September 24, 2017
doi:
10.3791/56277
, , , , , , ,
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine,Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London, 3HICoE Centre for Drug Research,Universiti Sains Malaysia

Summary

プロトコルの目的は、プライマリ ブタ脳血管内皮細胞 (pBECs) に基づく体外血液脳関門 (BBB) モデルの確立のための最適化手順を提示することです。モデルを示しています高再現性、高気密性、輸送および創薬における細胞内輸送の研究に適しています。

Abstract

このプロトコルの目的提示浄化と pBECs のと体外血液脳関門 (BBB) モデル モノカルチャー (MC)、アストロ サイト調整培 (ACM) と MC で pBECs に基づく栽培に最適化されたプロシージャと非接触ブタのアストロ サイトとの共培養 (NCC) またはラットの起源。pBECs は隔離され、国内豚 5-6 ヶ月歳の脳皮質から毛細血管のフラグメントから培養されました。これらのフラグメントは、髄膜、分離および灰白質、ろ過、酵素消化、遠心分離の均質化を慎重に除去して精製しました。汚染細胞をさらになくすためには、キャピラリーの断片がピューロマイシン含有培養した培地。60 ~ 95% 合流 pBECs キャピラリーのフラグメントから成長したに継代し、透過性の膜フィルターが挿入され、モデルに設立されました。次の差別化要因と扱われた細胞バリア堅さと BBB pBECs の特徴的な表現型を増加する: 膜側の透過物 8-CPT-キャンプ (ここで省略のキャンプ)、ヒドロコルチゾン、ホスホジエステラーゼ阻害薬、RO-20-1724(RO)。手順は、9-11 日の期間にわたって実施された、アストロ サイトが 2-8 週間前もってを培養した NCC モデルを確立するとき。プロトコルに記載されている手順の遵守が厳しく制限されている傍細胞透過性の内皮層の確立を許可している、NCC (TEER) 1249 ± 80 Ω cmの平均内皮下電気抵抗を示すモデル2と傍細胞透過性 (Pアプリ) ルシファー 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 秒-1の黄色の (± SEM を意味する n = 55)。この pBEC 表現型のさらなる評価のタイトな接合部蛋白質クローディン 5、良い表現を示した ZO 1、オクルディンと単接合蛋白 p120 カテニン。健康および病気の BBB の研究の範囲の提示されたモデルを使用ことができますそして、厳しい傍細胞透過性このモデル輸送と細胞内輸送の研究に適しています。

Introduction

血液-脳関門の細胞の構造と機能

循環、中央神経系 (CNS) のインターフェイスで BBB は適切な機能と神経系の保護のために不可欠である中枢神経系微小環境の homoeostatic コントロールのキー規制サイトとして機能します。BBB のサイトは血管内腔内皮細胞です。脳の毛細血管の内皮細胞を形成する複雑な細胞間のタイトな接合と特定の流入と流出のトランスポーターの強く偏光式パターン血液と脳1の間非常に特定の分子輸送の確保します。タイト結合錯体の構造コンポーネント オクルディンとクローディン家族、精巣毛細血管(ZO) 蛋白質、cingulin からの蛋白質を含めるし、接合部接着分子 (ジャム) を関連付けられています。クローディン 5 は傍細胞接合部制限で特に重要です。この特徴的な BBB 内皮細胞表現型の誘導そして維持を一緒に脳血管内皮細胞フォームは基底膜ニューロンとアストロ サイト ペリサイト周囲の細胞とのダイナミックな相互作用を含む、神経血管ユニット (NVU)2,3。これらの相互作用に関与するメカニズムがまだ完全に理解されない、しかし、短期的に BBB 透過性の調節ができ、長期 BBB 機能4を誘導する細胞間化学信号の交換が含まれます。アストロ サイトは特に脳血管内皮細胞の表現型に貢献する知られているし、グリア由来神経栄養因子 (細胞内 cAMP に影響を与える)5、塩基性繊維芽細胞成長因子6、規制などのソースは、ヒドロコルチゾン7、および変換増殖因子 β (TGF-β)8。しかし、TGF-β の効果は議論9をされています。

生体内での in Vitro BBB から

BBB 生物学に関する貴重な情報を提供するin vivo研究継続します。ただし、細胞モデルは追加の洞察力を提供し、健康および病気の BBB の詳細な分子と機能的な側面を理解するための便利なツールを構成できます。BBB の成分と細胞のタイプ間の複雑な相互作用が生体外モデルを完全に達成することは困難、以来があった、脳血管内皮細胞の最初の精製とモノラル文化にこれらのアプリケーション10,11,12、浄化手順と BBB の成長条件の広範な開発培養細胞モデル、体内バリアに大きい類似に 。一般的に使用される生体外でBBB モデルは、齧歯動物、ブタ、ウシ由来の初代培養細胞および不死化細胞株に基づいています。各モデルには、さまざまな長所と欠点があります。比較とモデルの選択、BBB 構造タンパク質受容体、酵素、トランスポーターの発現など検証マーカーが現在確立されたモデル1の概要を作成する使用されます。

プロトコルの目的

BBB の 1 つの重要な特徴は気密バリア性と高い TEER まだ利用可能なモデルの数が多いが反映しても体内のレベルです。いくつかの研究所から開発・最適化への取り組みを取り入れ、このプロトコルの目的は、プライマリ プライマリ pBECs MC ACM の有無、NCC に基づく BBB モデル体外高 TEER を確立する方法を提示するにはラットや豚由来のアストロ サイトは。応用手順およびモデルの確立汚染細胞を排除し、pBECs の BBB の表現型への分化を改善する努力があります。この作品は低傍細胞透過性とタイトな接合部の主要なタンパク質、トランスポーター、および受容体の機能発現を良いと信頼性の高い、高 TEER モデルの確立になりました。ただし、アストロ サイトは脳血管内皮細胞の表現型に貢献の要因、文化の 3 つの異なる条件は脳血管内皮細胞の 3 つの異なった表現型を表します。NCC モデルは創、運輸研究と細胞内輸送に関与する特定の専門にされたメカニズムの研究だけでなく、細胞間相互作用の調査のため特に有益で BBB 機能の最大の表現が、有利であります。

プロトコルの起源と歴史

ここで説明した pBEC モデルは、ルイーズ ・ モーガン博士と同僚は、成功以前ウシ脳血管内皮細胞モデル13に基づく方法でエーザイ研究所 (ロンドン) で開発された豚のモデルに基づいています。セル準備の元のメソッドは、純度を改善するために二次培養の手順に続いて、微小血管をキャッチするメッシュのナイロンを使用して 2 段ろ過が。メソッドの以前の開発、最適な BBB の表現型とバリアの堅さは ACM を含む補足の媒体の成長によって達成されました。メソッドにさらに変更は、マンチェスター英国14,15教授 (名) rothwell さんのラボで r. スキナーによって作られました。メソッドは、アボットの研究室、KCL ロンドン、どこ Patabendige では、大幅に簡単にアストロ サイトまたは ACM の使用の回避によって、ピューロマイシンをペリサイトなど汚染細胞を排除する準備をした。 によって採用されました。初論文 MC モデルに、生体内でBBB、効果的なタイトな接合、膜輸送系受容体を介したトランスサイトーシス16,17などのいくつかの重要な機能が保持されることを確認しました。,18,19,20. S. ユソフ後再び培養アストロ サイトをテストし、これはアボット ラボ21で現在使用されている最寄りのバリアント、TEER、大幅それを発見します。モデルが正常にされている今簡素化灰色を含む問題抽出、1 つだけメッシュろ過ステップ、および単一のフィルター コーティングの手順を使用して、m. ニールセンに転送ラボ オーフス、さらに変更がされているの導入 (そのプロトコルに関して)コラーゲンとフィブロネクチンを組み合わせること。豚アストロ サイト (このプロトコル) の分離の適用手順は、・ トムセンら22で説明したオールボーで t. Moos 研究室で開発したプロトコルに基づいていた。TEER とロンドンとオーフスで生成されたモデルの他のプロパティは、モデル ラボ間で転送が容易に、注意深い観察と方法の手順の合理化によく反応するという考えに信任を貸す、似ています。確かに、s. ユソフはローカル条件およびティッシュ ソースにさらに調整を関与している熱帯の国 (マレーシア)23に、今 MC モデルを確立しています。

別の方法や現在の利点は、モデルを確立

PBECs ウシおよび齧歯動物の起源の脳血管内皮細胞に比べると、次の分離24生体内でBBB の表現の損失の低い率を持っていることの利点を提供します。さらに、pBECs、bEND.5 と bEND.3 (50 Ω cm2) など細胞の単分子膜のよく報告されるレベルと比べて MC (800 Ω cm2)16で育てられたときも比較的タイトな内皮障壁を形成できます。25,26,原発性脳腫瘍と cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30, 27(100-300 Ω cm2) マウスの血管内皮細胞ss =”xref”> 33,34,35,36とラット (100-300 Ω cm2)37,38。しかし、TEER は浄化と文化のプロシージャの依存関係を示しています。ほとんどの場合、ACM の追加やアストロ サイトとの共培養内皮層1の気密性の内皮細胞で増加差別化効果に示します。それにもかかわらず、培養条件を最適化する努力、牛ベースのモデルのみを示している TEER 値豚ベース モデル (800 Ω cm2 MC、最大 2500 Ω cm2の培養アストロ サイトの平均) に匹敵する13 ,,3940,41,42,43,44,45。ウシ脳に基づくモデルとして内皮細胞は大きな変動、研究所14,45,46,47,48, 内と間を示しています。再現性は問題になる可能性があります。ここで報告 pBEC モデルで貢献の研究所は変動の少ない、両方の研究所の間で非常によく似た TEER と傍細胞透過性の値を達成しています。したがって、それはここで紹介した方法を使用して低い変動と堅牢なモデルを確立する他の研究所の可能なはず。タイトな内皮細胞層を形成するに加え pBECs を持つモデルがタイト結合蛋白質、機能 BBB トランスポーター、受容体、酵素、及び実証適性研究15の範囲の表現によって検証されて以前,16,17,19,20,22,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59。 さらに、pBECs の共培養に未発表のトランスクリプトーム データは BBB トランスポーターと受容体 (未発表結果、ニールセンら) の予想されるプロファイルを示しています。

豚の病気の進行を反映60、好ましい特徴の他の確立されたモデルよりも高い程度に人間の生物学とゲノム、解剖学、生理学、豚ベースの BBB モデルがそれ以上の利点、製薬業界。ブタ脳肉業界の共通の副産物であると血管内皮細胞、動物実験のために必要な 1 つのブタの脳から高純度精製収率を提供するの数を最小限に抑える脳の簡単にアクセスできるソースそれら構成します。浄化の一次電池の耕作はやや時間がかかるとモデルの設定の標準化のための専門知識が必要ですが、一次電池は最も信頼性の高い BBB モデルを生成します。不死化細胞株はバリアの堅さ、トランスポーター発現プロファイルと微小環境規制が生体内で実験結果61,を反映していないなど重要なプロパティとして、代用をすることはできません。62体外モデルは、生細胞の高解像度のイメージング、目標を使用してサンプリングまたは観察された細胞に近いアプローチを許可することで細胞内のプロセスの可視化を実現の利点を提供。高倍率と優れた光学的品質63。これは生きている動物の 2 光子顕微鏡の使用のためのケースではありません。さらに、体外モデルは、タグ付きタンパク質の可視化や、人身売買の調査を許可するセルを使って能力を提供します。

モデルの応用

BBB の機能は固定されていないと生理学と病理学の両方で動的に変調することができます。神経変性を含む多くの神経学的な病気で炎症・感染症、混乱、BBB の透過性亢進には、64,65,66,67 が観察されます。.減らし、病気の進行や後の損傷を防ぐために、BBB の変調の基礎となる分子メカニズムの同定と解析、主要な重要です。このコンテキストで信頼性の高い体外モデルは、製薬業界での高い需要と、さらに中枢神経系薬の BBB 透過性を予測する上で重要な役割を果たします。透過スクリーンとして任意の生体外モデル制限傍細胞経路、生理学的に現実的な細胞アーキテクチャおよび機能発現トランスポーター メカニズム68が表示されます。以前研究16,17,57, と傍細胞透過性とここで TJ と AJ タンパク質の発現を示した本モデルこれらのすべての条件を満たして、BBB の範囲に適しています両方の通常の生理学と病理学を研究。提示の浄化と栽培方法の強みには、シンプルさの組み合わせ、結果堅牢で信頼性の高い高 TEER体外BBB モデルで再現性とアストロ サイトを含める機能に影響を与えるがあります。この目的は、ブタのアストロ サイトとラットの起源が同様の方法22pBECs の BBB の表現型を拡張するために示されています。

Protocol

ブタ脳がデンマークの食品産業の副産物として得られました。デンマーク食肉処理場が厳しい監督とデンマーク環境省および食品による観測。 ラット アストロ サイトの分離に使用で飼育されグループはデンマーク語によると獣医の検査の下で 12/12 h ダーク/ライト サイクル、22-23 ° C の周囲温度でローカル動物施設で建物実験動物のための規則。ラットは、彼らが動物…

Representative Results

BBB のIn Vitroモデルの確立 提示された、最適化された方法で pBECs の栽培やアストロ サイト (図 1) と MC 有無 ACM または NCC 透過膜挿入システムの確立実施した 9-11 日間 (図 2)。内皮細胞の選択、精製されたキャピラリー フラグメントの初期の文化は、ピューロマイシン最大 5 ?…

Discussion

精製と pBEC の増殖

浄化のプロシージャの間には、重要な手順は、髄膜の迅速かつ効果的な除去・分離精製収率、純度およびモデルの適切な設置が重要です白と灰色の物質に含まれます。提示された体外BBB モデルの pBECs を使用して、我々 は改善し、孤立した灰白質、サイズ選択的微小血管、コラゲナーゼで消化の隔離のためのフィルタ リングの機械的均質化に基づ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、テクニカル サポート、エリザベート ヘレナ ブルーン、サラ クリスティン ・ クリステンセン、ニルス ・ m ・ クリステンセンを認識したいし、ルンドベック財団許可番号 R155 2013 14113。

Materials

Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc
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Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).
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