Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Summary

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed – hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Abstract

Het doel van dit protocol presenteert een geoptimaliseerde procedure voor de zuivering en de teelt van pBECs en om vast te stellen in vitro bloed – hersenbarrière (BBB) modellen, gebaseerd op de pBECs in mono-cultuur (MC), MC met Astrocyt-geconditioneerd medium (ACM), en contactloze co cultuur (NCC) met astrocyten van varkens- of rat oorsprong. pBECs waren geïsoleerd en gekweekt uit fragmenten van haarvaten van de cortices van de hersenen van binnenlandse varkens 5-6 maanden oud. Deze fragmenten werden gezuiverd door zorgvuldige verwijdering van de hersenvliezen, isolatie en homogenisering van de grijze stof, filtratie, enzymatische spijsvertering en centrifugeren. Om te verder elimineren contaminerende cellen, de capillaire fragmenten werden gekweekt met puromycin-bevattende medium. 60-95% heuvels, pBECs groeien uit de capillaire fragmenten waren gepasseerd te permeabel membraanfilter wordt ingevoegd als vastgesteld in de modellen. Ter verbetering van de barrière krapte en BBB karakteristiek fenotype van pBECs, de cellen werden behandeld met de volgende factoren van de differentiatie: permeant 8-CPT-kamp van de membraan (hier afgekort kamp), hydrocortison, en een fosfodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). De ingreep was uitgevoerd over een periode van 9-11 dagen, en bij de vaststelling van de NCC-model, de astrocyten 2-8 weken van tevoren werden gekweekt. Naleving van de beschreven procedures in het protocol heeft toegestaan de oprichting van endothelial lagen met zeer beperkt paracellular permeabiliteit, met de NCC model tonen een gemiddelde signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER) van 1249 ± 80 Ω cm ², en paracellular permeabiliteit (P_app) voor gele Lucifer van 0.90 10^-6 ± 0.13 10^-6 cm sec^-1 (bedoel ± SEM, n = 55). Verdere evaluatie van deze pBEC fenotype toonde goede uitdrukking van de strakke regulates eiwitten claudin 5, ZO-1, occludin en adherens junction eiwit p120 catenine. Het model gepresenteerd kan worden gebruikt voor een aantal studies van de BBB in gezondheid en ziekte en met de zeer restrictieve paracellular permeabiliteit, dit model is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire mensenhandel.

Introduction

Cellulaire structuur en functie van de bloed – hersen barrière

Op het grensvlak van de bloedsomloop en het centrale zenuwstelsel (CNS) fungeert de BBB als een belangrijke regelgevende site voor homoeostatic controle op de communicatie van de CNS, die is van essentieel belang voor de werking en bescherming van het zenuwstelsel. De site van de BBB is de endotheliale cellen voering van het bloedvat lumen. In de haarvaten van de hersenen, endotheliale cellen vormen complexe intercellulaire strakke kruispunten en sterk gepolariseerde expressiepatronen van bepaalde toestroom en efflux vervoerders zorgen voor zeer specifieke moleculaire vervoer tussen het bloed en de hersenen ¹. De structurele onderdelen van de strakke junction complexen bevatten eiwitten uit de occludin en claudin familie, de zonula occludens (ZO) eiwitten, de cingulin, en bijbehorende regulates celadhesie-moleculen (Jam). Claudin 5 is vooral belangrijk in de paracellular regulates beperking. Inductie en onderhoud van deze karakteristieke BBB endothelial fenotype dynamische interacties met de omringende cellen, met inbegrip van de membranen van de kelder, die samen met de hersenen endotheliale cellen van vorm, pericytes, astrocyten en neuronen betrekken de neurovasculaire eenheid (NVU)^2,3. De mechanismen die betrokken zijn bij deze interacties worden nog niet volledig begrepen, maar omvatten uitwisseling van chemische signalen tussen cellen, waardoor modulatie van de permeabiliteit van de BBB op korte termijn en lange termijn BBB functies⁴induceert. Astrocyten vooral bij te dragen tot de hersenen endothelial cel fenotype zijn bekend en zijn een bron van regelgevende factoren zoals gliale-afgeleide neurotrophic factor (die intracellulaire cAMP)⁵, fundamentele fibroblast groeifactor⁶, Hydrocortison⁷en transformerende groeifactor β (TGF-β)⁸. Het effect van TGF-β, echter al besproken⁹.

Van In Vivo In Vitro BBB

In vivo studies blijven waardevolle informatie te verstrekken over BBB biologie. Cel cultuur modellen kunnen echter aanvullende inzichten en vormen nuttige hulpmiddelen voor het begrijpen van de gedetailleerde moleculaire en functionele aspecten van de BBB in zowel de volksgezondheid als de ziekte. Hoewel de complexe interacties tussen de celtypes en bestanddelen van de BBB moeilijk om volledig in in vitro modellen, is er, sinds de eerste reiniging van endotheliale cellen van de hersenen en de toepassing hiervan in mono-culturen ^{10 , 11 , 12}, uitgebreide ontwikkeling van de zuiveringsprocedures en groei omstandigheden van de BBB mobiele cultuur modellen, wat resulteert in meer gelijkenis met de barrière in vivo . De meest gebruikte in vitro BBB modellen zijn gebaseerd op primaire cellen van knaagdieren, varkens en runderen oorsprong, en vereeuwigd cellijnen. Elk model heeft verschillende voor- en nadelen. Voor vergelijkings- en model keuze, worden validatie markeringen zoals expressie van BBB enzymen, vervoerders, receptoren en structurele proteïnen gebruikt voor het maken van Overzichten van de huidige gevestigde modellen¹.

Doel van het Protocol

Een belangrijk kenmerk van de BBB is barrière krapte en hoge TEER, maar een groot aantal van de beschikbare modellen weerspiegelen niet goed de in vivo -niveaus. Integratie van ontwikkeling en optimalisatie bijdragen van verschillende laboratoria, het doel van dit protocol is te presenteren een methode voor de vaststelling van een hoge TEER in vitro BBB model gebaseerd op de primaire pBECs in MC met of zonder ACM of in NCC met primaire astrocyten van rat of varkens oorsprong. De toegepaste procedures en de vaststelling van het model zijn inspanningen op te heffen van contaminerende cellen en ter verbetering van de differentiatie van pBECs in een BBB fenotype. Dit werk heeft geleid tot de oprichting van betrouwbare, hoge TEER modellen met lage paracellular permeabiliteit en goede functionele uitdrukking van belangrijke strakke regulates eiwitten, vervoerders en receptoren. Echter, zoals de astrocyten een factor die bijdraagt tot de hersenen endothelial cel fenotype zijn, de drie verschillende voorwaarden van cultuur vertegenwoordigen drie verschillende fenotypes van endothelial hersencellen. De NCC-model is specifiek nuttig voor studies van bepaalde gespecialiseerde mechanismen die betrokken zijn in de Geneesmiddelenontwikkeling, vervoer studies en intracellulaire mensenhandel, evenals voor onderzoek van de cel interacties waar maximale expressie van BBB functies voordelige.

Oorsprong en geschiedenis van het Protocol

Het model van de pBEC hier beschreven is grotendeels gebaseerd op de varkens model ontwikkeld bij Eisai Laboratories (Londen) door Dr. Louise Morgan en collega’s, op basis van een succesvolle eerdere boviene hersenen endothelial cel model¹³whichis. De originele methode van cel voorbereiding was een twee-traps filtratie met behulp van nylon netten om te vangen van de microvessels, gevolgd door een subculturing stap ter verbetering van de zuiverheid. In de eerdere ontwikkeling van de methode, optimale BBB fenotype en barrière krapte werden bereikt door groei in aangevuld medium, met inbegrip van ACM. Verdere wijzigingen in de methode werden gemaakt door R. Skinner in Prof N. Rothwell van lab in Manchester UK^14,15. De methode werd aangenomen door het laboratorium van Abbott, KCL Londen, waar Patabendige het aanzienlijk eenvoudiger maakte te bereiden door het vermijden van het gebruik van astrocyten of ACM en door het wegnemen van contaminerende cellen zoals pericytes met puromycin. De eerste papieren bevestigd dat de MC-model enkele belangrijke kenmerken van de in vivo BBB behouden, met inbegrip van doeltreffende strakke kruispunten, membraan vervoerssystemen en receptor-gemedieerde transcytosis^{16,17 , 18 , 19 , 20}. later S. Yusof opnieuw getest Astrocyt co cultuur en het aanzienlijk verbeterd TEER, dus dit de gewenste variant die momenteel worden gebruikt in het Abbott lab^{21 is}. Het model is inmiddels met succes overgebracht naar de M. Nielsen lab in Aarhus, waar verdere wijzigingen zijn ingevoerd (dit protocol), met inbegrip van vereenvoudiging grijs uit extractie, met behulp van slechts één mesh filtratie stap, en een Enkelfilter coating het combineren van collageen en fibronectine. De toegepaste procedure voor het isoleren van varkens astrocyten (dit protocol) was gebaseerd op protocollen ontwikkeld door het laboratorium van T. Moos in Aalborg, beschreven door Thomsen et al.²². De TEER en andere eigenschappen van het model gegenereerd in Londen en Aarhus lijken, die vertrouwen op het idee dat het model wordt gemakkelijk overgedragen tussen labs en reageert goed op zorgvuldige observatie en rationalisatie van de stappen van methode leent. Inderdaad, heeft S. Yusof nu de MC-model in een tropisch land (Maleisië)²³, die verdere aanpassing voor plaatselijke omstandigheden en weefsel bronnen betrokken opgericht.

Voordelen boven alternatieve methoden en momenteel gevestigd modellen

Vergeleken met endothelial hersencellen van oorsprong van de runderen, knaagdieren, bieden pBECs het voordeel van een lager tarief van verlies van het in vivo BBB fenotype na isolatie²⁴. Bovendien kunnen pBECs vormen vrij krap endothelial belemmeringen, zelfs als volwassen in MC (800 Ω cm²)¹⁶ in vergelijking met de vaak gerapporteerde niveaus voor monolayers van cellijnen zoals bEND.5 en bEND.3 (50 Ω cm²) ^{25 , 26 , 27}, cvoleinding (300-800 Ω cm²)^28,29,30, en cerebEND (500 Ω cm²)^29,31,32, en de primaire hersenen endotheliale cellen van muis (100-300 Ω cm²)SS = “xref” > 33^,34,35,^,36 en rat (100-300 Ω cm²)^37,38. De TEER leert echter afhankelijkheid op de procedures voor zuivering en cultuur. In de meeste gevallen toont de toevoeging van ACM of co cultuur met astrocyten onderscheidende effecten op de endotheliale cellen en een toename in dichtheid van het endotheel lagen¹. Echter over het streven naar het optimaliseren van de kweken voorwaarden, alleen de runderen-gebaseerde modellen hebben aangetoond TEER waarden vergelijkbaar met de varkens-gebaseerde modellen (gemiddelden voor 800 Ω cm² in MC, maximaal 2500 Ω cm² in Astrocyt co cultuur)^{13 ,39,40,41,42,43,44,45}. Als de modellen op basis van primaire boviene hersenen hebben endotheliale cellen aangetoond grote verschillen, zowel tussen als binnen laboratoria^{14,45,46,47,48}, reproduceerbaarheid zou een probleem zijn. In het pBEC-objectmodel gemeld hier, hebben de bijdragende laboratoria bereikt zeer vergelijkbaar TEER en paracellular permeabiliteit waarden met lage variabiliteit, zowel in als tussen laboratoria. Vandaar, moet het mogelijk zijn voor andere laboratoria tot stand brengen van een robuust model met lage variabiliteit met behulp van de methode die hier gepresenteerd. Naast het strakke endothelial lagen vormen, zijn modellen met pBECs eerder gevalideerd door expressie van strakke junction eiwitten, functionele BBB vervoerders, receptoren en enzymen en bewezen geschiktheid voor allerlei studies^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. Bovendien ongepubliceerde transcriptome gegevens over de mede culturen van pBECs blijkt een verwachte Profiel van BBB vervoerders en receptoren (niet-gepubliceerde resultaten, Nielsen et al.).

De BBB varkens gebaseerde model heeft een bijkomend voordeel als het genoom, anatomie, fysiologie, en de progressie van de ziekte van het varken overeen met de menselijke biologie aan een hogere mate dan andere gevestigde modellen beschikt over⁶⁰, die gunstig zijn voor de farmaceutische industrie. Als varkens hersenen een gemeenschappelijk bijproduct van de vleesindustrie zijn, vormen ze een gemakkelijk toegankelijke bron van hersenen endotheliale cellen, het aantal dieren die nodig zijn voor de experimenten, en het verstrekken van een hoge zuivering opbrengst van één varkens hersenen minimaliseren. Hoewel zuivering en teelt van primaire cellen is enigszins tijdrovend en vereist expertise voor normalisatie bij het opzetten van het model, primaire cellen genereren de betrouwbaarste BBB-modellen. Vereeuwigd cellijnen kunnen invaller, niet als belangrijke eigenschappen zoals barrière benauwdheid, vervoerder expressieprofielen en communicatie regelgeving komen niet overeen met de experimentele bevindingen in vivo^{61, 62}. in vitro modellen bieden het voordeel van live-cel imaging met een hogere resolutie, waardoor de visualisatie van intracellulaire processen mogelijk doordat een benadering dicht naar de bemonsterde of waargenomen cellen, met doelstellingen met hogere vergroting en betere optische kwaliteit⁶³. Dit is niet het geval voor het gebruik van twee-foton microscopie in levende dieren. In vitro modellen bieden bovendien de mogelijkheid om transfect cellen, waardoor de visualisatie van tagged eiwitten en onderzoek van hun handel.

Toepassingen van het Model

De functie van de BBB is niet vast en kan dynamisch worden gemoduleerd in zowel de Fysiologie en pathologie. In veel neurologische ziekten, met inbegrip van neurodegeneratieve, wordt ontstekings-en infectieziekten, verstoring en verhoogde permeabiliteit van de BBB waargenomen^64,65,66,67 . Om te verminderen en voorkomen van de progressie van de ziekte en vervolgschade, zijn identificatie en karakterisering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de modulatie van de BBB van groot belang. In dit verband, betrouwbare in vitro modellen zijn in de hoge vraag door de farmaceutische industrie, en bovendien spelen een belangrijke rol in het voorspellen van BBB permeabiliteit van drugs naar de CNS. Een in vitro model van het bijeenkomen van een scherm van de permeabiliteit moet een restrictieve paracellular traject, een fysiologisch realistische cel architectuur en functionele expressie van vervoerder mechanismen⁶⁸worden weergegeven. Aangetoond in eerdere studies^16,17,57, en door paracellular permeabiliteit en expressie van TJ en AJ eiwitten hier, het gepresenteerde model voldoet aan al deze criteria en is geschikt voor een scala van BBB studies in zowel normale fysiologie en pathologie. De sterke punten van de onderhavige zuivering en cultivatie methode bestaan uit een combinatie van eenvoud en reproduceerbaarheid en de mogelijkheid om op te nemen astrocytic beïnvloeden met een resulterende robuuste en betrouwbare hoge TEER in vitro BBB model. Voor dit purpose, astrocyten van varkens en rat oorsprong is aangetoond dat het vergroten van de BBB fenotype van pBECs in een soortgelijke manier²².

Protocol

varkens hersenen werden verkregen als bijproduct van de Deense voedingsindustrie. Deense slachthuizen staan onder streng toezicht en -waarneming door de Deense Ministerie voor milieu en voedsel. gebruikt voor isolatie van astrocyten ratten werden gefokt en groep-gevestigd in de lokale dier faciliteit bij een kamertemperatuur van 22 ° C – 23 ° C en op een cyclus van 12/12 h donker/licht onder controle van de dierenarts en volgens Deens verordeningen voor lab dieren. De ratten werden euthani…

Representative Results

Oprichting van de BBB In Vitro modellen In de gepresenteerde, geoptimaliseerde methode, werd teelt van pBECs en de vestiging van de ordening van de invoegen permeabel membraan met MC of zonder ACM of NCC met astrocyten (Figuur 1) uitgevoerd voor een periode van 9-11 dagen (Figuur 2). Voor de selectie van endotheliale cellen, een eerste cultuur van gezuiverde capil…

Discussion

Zuivering en proliferatie van pBEC

Tijdens de procedure van de zuivering omvatten kritische stappen snelle en effectieve verwijdering van hersenvliezen en scheiding van de witte en grijze materie, die belangrijk is voor de opbrengst van de zuivering en de zuiverheid en de juiste instelling van het model. Voor het gepresenteerde in vitro BBB model met behulp van pBECs, hebben we verbeterd en vereenvoudigd een zuivering procedure op basis van mechanische homogenisering van geïsoleerde gri…

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc