Summary

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Published: November 28, 2017
doi:

Summary

L’obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

Abstract

Metodologie attuali per l’uccisione di antigene-specifiche sono limitate per uso in vitro o utilizzati in modelli di malattie infettive. Tuttavia, c’è non un protocollo specificamente destinato a misurare antigene-specifiche uccisione senza un’infezione. Questo protocollo è stato progettato e descrive i metodi per superare queste limitazioni, consentendo per la rilevazione dell’antigene-specifiche uccidendo una cella obiettivo di CD8+ T cells in vivo. Ciò avviene mediante l’Unione di un modello di vaccinazione con un tradizionale CFSE-etichetta target uccidendo il dosaggio. Questa combinazione consente al ricercatore di valutare il potenziale CTL di antigene-specifiche direttamente e velocemente come il dosaggio non è dipendente della crescita del tumore o infezione. Inoltre, la lettura si basa sulla citometria a flusso e quindi dovrebbe essere facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La limitazione principale dello studio consiste nell’identificare la timeline in vivo che è appropriato per l’ipotesi in fase di test. Variazioni nella forza di antigene e mutazioni nelle cellule T che possono derivare in funzione citolitica differenziale devono essere attentamente valutati per determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule e valutazione. La concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per hgp10025-33 e OVA257-264, ma occorrerebbero ulteriori convalida per altri peptidi che potrebbero essere più appropriati per un determinato studio. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Introduction

Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8+ o CD4+ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l’uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSECiao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSElo-pulsati cellule rimangono contrassegnati dell’obiettivo. Le cellule sono poi iniettate con un rapporto 1:1 e valutate per la perdita della CFSECiao-etichettato pulsati obiettivi di flusso cytometry4. Modelli di vaccino e rifiuto hanno utilizzato anche strategie simili per valutazione di in vivo uccidendo entrambi CD8+ e CD4+ T cellule così come cellule NK5,6. Questo è un potente, ma richiede l’uso di agenti infettivi che innescano il sistema immunitario prima dell’iniezione di destinazione.

Questo protocollo, d’altra parte, non richiede nessuna infezione priore dell’host e invece utilizza una strategia di vaccinazione per primo il sistema immunitario prima dell’iniezione di destinazione. Questa vaccinazione è composto da una formulazione a base di acqua di vaccino del peptide che richiede la fornitura di un immunostimolante cocktail chiamato covax7, costituito da un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonistico l’anticorpo e l’interleuchina 2 (il-2) che conduce alla combinazione sinergica di immunostimulatory agenti per l’ottenimento dei peptidi specifici adescamento e risposta immunitaria robusta. Come tale, questo test fornisce una rapida lettura della funzione CTL come il vaccino è somministrato insieme con le cellule per la valutazione della funzione solo tre giorni prima dell’iniezione delle cellule bersaglio. Inoltre, l’innesco di covax è abbastanza forte che si può vedere la capacità di uccisione della cellula T antigene-specifiche innescata tra 4 e 24 h dopo l’iniezione.

La limitazione principale di questo protocollo è l’identificazione della timeline in vivo per la rilevazione dell’uccisione di destinazione che è opportuno sia l’antigene e l’ipotesi da testare. Attenta valutazione deve essere effettuata, come variazioni nella forza di antigene così come le alterazioni genetiche in cellule di T in fase di test potrebbe causare funzione differenziale di CTL che richiederebbe un rilevamento di tempi diversi di uccisione di destinazione. Inoltre, mentre la concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per melanoma umano antigene glicopeptide 100 (hgp10025-33) e ovoalbumina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso di un altro modello di antigene che può essere più appropriato per un dato studio richiederebbe ulteriore convalida. A causa delle differenze attese nella capacità degli antigeni di un obiettivo di stimolare la CTL effettrici funzione in combinazione con il covax come adiuvante, ottimizzazione della frequenza di concentrazione e dose dose IL-2 può essere essenziale per raggiungere l’obiettivo desiderato. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center. 1. preparazione del Peptide per il vaccino Sciogliere il peptide liofilizzato con tampone fosfato salino (PBS) alla concentrazione appropriata e vortexare per 30 s.Nota: Per hgp10025–33, la concentrazione finale è 1 mg/mL e per OVA257–264, la concentrazion…

Representative Results

Prima dell’iniezione delle cellule bersaglio CFSE-etichetta, la miscela di 1:1 cella viene eseguita su un citometro a flusso per determinare le frequenze di base il CFSECiao sia CFSElo destinazione delle cellule. Figura 1 A Mostra la strategia di gating per rilevare i cambiamenti nelle popolazioni CFSE, un cancello iniziale viene effettuato utilizzando parametri FSC e SSC. Le cellule di CFSE-positive totale sono quindi s…

Discussion

Mentre questo protocollo è molto semplice, ci sono pochi passaggi critici che devono essere eseguite con cautela. L’innesco di covax dopo l’iniezione della cellula-T antigene-specifiche in fase di test è necessario vedere qualsiasi uccisione degli obiettivi pulsati. Mentre è possibile che la vaccinazione di base acqua covax crea uno stato infiammatorio acuto, per la fase infiammatoria cronica, sostituendo la formulazione a base di acqua di breve durata con un approccio basato su olio di antigene lento rilascio può pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato da ricerche di NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), Grant di ricerca istituzionali (RN), Start-up concedere (RN) e seme di MD Anderson CIC concedere (RN).

Materials

6- to 12-week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12-week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

References

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Cite This Article
Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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