Summary

在体内应用免疫模型检测抗原特异性 T 细胞细胞功能的试验

Published: November 28, 2017
doi:

Summary

该协议的目标是允许检测在小鼠模型中的靶细胞的体内抗原特异性杀伤。

Abstract

目前用于抗原特异性致死的方法仅限于在感染性疾病模型中使用或应用于体外。然而, 没有一项专门用于测量不感染抗原特异的杀伤的协议。本协议设计并描述了克服这些限制的方法, 允许通过 CD8+ T 细胞体内检测目标细胞的抗原特异性杀伤。这是通过将疫苗接种模型与传统的 CFSE 标靶杀伤试验结合起来完成的。这种结合使研究人员能够直接和快速地评估抗原特异的 CTL 电位, 因为这种检测不依赖于肿瘤的生长或感染。此外, 读数是基于流式细胞仪, 因此应该容易接近大多数研究员。该研究的主要限制是确定适合于所测试的假设的时间轴在体内。在 T 细胞的抗原强度和突变的变化, 可能导致差异细胞功能需要仔细评估, 以确定最佳时间的细胞收获和评估。对于 hgp10025-33和卵子257-264, 已优化了用于疫苗接种的适当浓度的肽, 但对于可能更适合于特定研究的其他肽, 则需要进一步验证。总的来说, 该协议允许快速评估杀死功能在体内, 可以适应任何给定的抗原。

Introduction

存在多个协议来评估 CD8+或 CD4+ T 单元格的细胞 (CTL) 电位。这种评估可以很容易地做在体外在受控条件下1,2,3。此外, 传染病模型, 如 LCMV, 通过使用差异 CFSE (5-(和 6)-羧基双乙酸琥珀酰亚胺酯) 对 CTL 功能进行了经典的检查, 标记为 CFSEhi标记的单元格的目标单元格脉冲与多肽和 CFSElo标记的目标细胞是左 unpulsed。然后, 以1:1 的比率注入细胞, 并通过流式细胞仪4对 CFSEhi标记的脉冲目标的丢失进行评估。疫苗和排斥模型也使用类似的策略, 评估的在体内杀害的 CD8+和 CD4+ T 细胞以及 NK 细胞5,6。这是一个强有力的化验, 但需要使用的传染性药物, 在靶注射前免疫系统的首要。

这个协议, 另一方面, 不需要事先感染的主机, 而是利用疫苗接种策略, 以在目标注射前的免疫系统的首要。这种疫苗接种是由多肽疫苗的水基配方, 需要提供一种免疫鸡尾酒称为 covax7, 由 Toll 样受体 7 (TLR7) 激动剂 (莫特霜), 竞赛 anti-CD40抗体和 interleukin-2 (IL-2) 导致免疫剂的协同组合, 以诱导肽特异性启动和强健的免疫应答。因此, 这种化验提供了一个 CTL 功能的快速读数, 因为疫苗是在注射靶细胞前的三天内与细胞一起进行功能评估的。此外, covax 启动足够强, 注射后的抗原特异性 T 细胞的杀伤能力可以看到4和24小时。

该协议的主要限制是确定时间轴在体内检测目标杀死, 这是适当的抗原和假设被测试。必须进行仔细的评估, 因为抗原强度的变化以及在 T 细胞中测试的基因改变可能会导致不同的 CTL 功能, 这就需要对目标杀伤的定时检测。此外, 虽然适当浓度的肽接种已优化人类黑色素瘤抗原糖 100 (hgp10025-33) 和蛋白257-264 (卵257-264)8,9 ,使用另一个可能更适合于某项研究的抗原模型将需要进一步验证。由于预期的目标抗原的能力, 以刺激 CTL 效应功能与 covax 作为佐剂, 优化 IL-2 剂量浓度和剂量频率可能是必不可少的, 以达到预期的目标。总的来说, 该协议允许快速评估杀死功能在体内, 可以适应任何给定的抗原。

Protocol

这里描述的所有方法都得到了德克萨斯大学安德森癌症中心的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准。 1. 疫苗用肽的制备 将冻干肽与磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶于三十年代的适当浓度和涡旋。注: 对于 hgp10025-33, 最终浓度为1毫克/毫升, 对于卵子257-264, 最终浓度为0.5 毫克/毫升。注射前重组肽。重建后不要存储。 </o…

Representative Results

在注射 CFSE 标记的靶细胞之前, 在流式细胞仪上运行1:1 单元混合物, 以确定 CFSEhi和 CFSElo目标单元格的基线频率。图 1A显示了用于检测 CFSE 种群变化的浇口策略, 使用 FSC 和 SSC 参数进行初始化。在评估频率变化之前, 总的 CFSE 阳性细胞 subgated, 因为相对于未标记的内生脾, 这个种群的数量比较小。CFSEhi和 CFSElo</su…

Discussion

虽然该协议很简单, 但还有一些关键步骤必须仔细执行。covax 注射后的抗原特异性 T 细胞被测试是必要的, 看到任何杀害的脉冲目标。虽然水基 covax 疫苗可能造成急性炎症状态, 为慢性炎症阶段, 取代短命的水基配方与缓慢抗原释放油的方法可能会产生更好的结果7,12

此外, 对于理想的流式细胞仪, 在抗原脉冲后的靶细胞的 CFSE 标记?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到 NIH 研究 (A1R03AI120027 (rn) 和 1R21AI20012 (rn)), 机构研究补助金 (rn), 启动补助金 (rn) 和 MD 安德森 CIC 种子补助金 (rn) 的支持。

Materials

6- to 12-week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12-week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

References

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Cite This Article
Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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