Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.
Transposon mutagenesis gene bozulma rasgele genomik ekleme bir transposon adı verilen DNA parçasının üzerinden sağlayan bir yöntemdir. İletişim kuralı aşağıdaki sefaloridin direnç işaretleyicisi içeren bir transposon barındıran bir plazmid bakteri suşları arasında yüksek verim aktarmak için bir yöntem özetliyor. Plazmid kaynaklı transposase alıcı gerilme çok düşük insertional önyargı ile genom transposon ekler bir varyant tnp gen tarafından kodlanır. Bu yöntem böylece hangi Transpozonlar genomik konumlarda benzersiz alıcı bir zorlanma, Escherichia coli ya Shigella flexneri bakterilerin içine eklenmiş olan büyük mutant kitaplıkları oluşturulmasına izin verir. Elektroporasyon ya da kimyasal dönüştürme gibi diğer yöntemlerin aksine bakteriyel konjugasyon kullanarak benzersiz klonlar yüzbinlerce ile büyük kütüphaneleri oluşturulabilir. Bu yüksek yoğunluklu ekleme kütüphaneler, gerekli olmayan genlerdeki her 4-6 baz çifti olarak sık sık olarak ortaya çıkan eklemeleri ile verir. Bir ucuz, kolay ve yüksek verimliliği yöntemi yoğun transposon ekleme Kütüphane yaratılması için izin veren bir yayın gibi diğer yöntemler için bu yöntem üstündür. Transposon Kütüphane-ebilmek var olmak kullanılmış (Tn-Seq), genetik etkileşim ağları, anlaması için sıralama transposon gibi aşağı akım uygulamalarda veya daha açıkçası, mutational (ileri genetik) ekranlar.
Transposon mutagenesis kütüphaneler bakterilerde oluşturulması uygulamaları keşifler bakteriyel patojenler1,2, virülans genlerin için gerekli genler3, çalışmalar arasında değişen, çok çeşitli için yararlıdır 4 , 5 , 6, genetik etkileşim tanımlaması için7,8,9ağlar. Bu çalışmalar için kritik mutantlar büyük bir kütüphanesi oluşturmak için yeteneğidir. Bir transposon veya bir gen düzenleyici bölgeye ait açık okuma çerçevesi ekleme kez işlev veya ifade bozabilir olacaktır gibi Transpozonlar (rasgele bir genom eklediğiniz kısa parçaları DNA) gen işlevi, dağıtmak için basit bir yol kullanılır Gen.
Burada özetlenen E. coli ya da S. flexneri transposon kitaplıkta bakteriyel konjugasyon istimal plazmid pJA110tarafından oluşturulması için bir yöntemdir. Bu plazmid kullanarak iki ana avantajı vardır. PJA1 plazmid ifade Tn10 transposase türevi indüklenebilir ve düşük ekleme önyargı11,12transposon rastgele genom entegre olacak anlamı, vardır ilk avantajdır zaman isopropil Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) medyaya eklenir. Transposon transposon ekler mutantlarla seçim içine alıcı zorlanma kromozom için izin veren bir sefaloridin direnç işaretçisi içerir. PJA1 plazmid ikinci avantajı R6K mutant kökeni çoğaltma içerir olduğunu. Çoğaltma R6K mutant kökeni lambda pir gen plazmid13bakımı için sırayla gerektirir. Plazmid pir – suşları içinde çoğaltma yapamaz gibi alıcı zorlanma (şekil 1) kaybolur. Bu Tn10 transposase hücreden kaldırılır ve artık daha fazla mutasyonlar ilk transpozisyon olayından sonra azaltarak etkin değildir sağlar.
Bakteriyel konjugasyon pJA1 plazmid donör zorlanma alıcı zorlanma için taşımak için çeşitli nedenlerden dolayı avantajlı kullanmaktır. Konjugasyon basit ve ucuz gerçekleştirmek ve bir electroporator gibi özel ekipman ihtiyacı yoktur. Ayrıca, bakteriyel konjugasyon yüksek verimlilik için çok büyük bir kütüphane sağlar (> 2 x 105 benzersiz eklemeleri) sadece bir kaç mililitre (mL) gecede bakteri kültürü6ile elde edilebilir. Süreç yaklaşık iki saatlik uygulamalı kuluçka kez birlikte ve bakterilerin büyümesini alır. Langridge vd. 130 electroporations gerçekleştirme transposon mutagenesis kitaplığa bir boyuttaki bir benzer oluşturmak için rapor 14 tek bir fiil ile elde8, burada açıklanan. Emek yoğun ve zaman alıcı hazırlık electrocompetent hücre ve malzemelerin kullanımı pek çok pahalı (örneğin, elektroporasyon cuvettes), vasıl a fiyat daha–dan $1.000 USD sarf malzemeleri yalnız içinde 130 electroporations kullanımını gerektirir. Diğer çalışmalar10 benzer yöntemler kullandık ama farklı bakteri suşları ve elde çok daha küçük kütüphane (5 x 104 koloni oluşturan birimler) daha boyutları ile rapor burada.
Donör zorlanma ile ilgili notlar: Burada kullanılan donör zorlanma E. coli yük pJA1 transposon plazmid16içeren BW2076715 olduğunu. Soy BW20767 pJA1 plazmid transferini yüksek verimli yapma diğer suşları için eşlenik. Ayrıca, önemlisi, lambda BW20767 mi pır +. Daha önce de belirtildiği gibi plazmid pJA1 sadece lambda pir gen içeren suşları muhafaza edilmesi yapabiliyor. Bu yük sefaloridin ve Ampisilin dayanıklı olduğunu. PJA1 plazmid Ampisilin direnç işaretçisi içeren ve bir sefaloridin direnç işaretçisi transposon içinde yer alıyor. Bu zorlanma Ampisilin 100 µg/mL istimal plazmid seçimi ile büyüyor. Bu da ifade edilen yapısal transposase genler barındıran diğer suşların kararsız olduğu bilinmektedir kayda değer, kullanılan transposase ise işte altında ise indüklenebilir kontrol, sızan ifade düşük riski kalır. Bu nedenle, bu bu zorlanma geçirilmesi indirilmelidir ve taze bir çizgi her yeni kütüphane hazırlık için dondurulmuş bir kültürden alınması gereken önerilmektedir. Burada kullanılan donör baskı laboratuarımızın istek üzerine mevcuttur.
Alıcı zorlanma ile ilgili notlar: alıcı zorlanma seçim, E. coli K12 kaynaklı laboratuar suşları veya soy-in S.flexneri (Ayrıca bkz: tartışma) gibi büyük bir yük olabilir. Alıcı zorlanma sefaloridin direnmek, değil bir ek antibiyotik direnci işaretleyici olmalıdır, böylece donör zorlanma karşı seçilebilir. İçin alıcı zor, bir E. coli MG1655 zorlanma burada tanıtılan spontan nalidixic asit mutasyon ile kullanılır. Spontan nalidixic asit mutant kaplama gecede kültür 200 µL aliquots 30 µg/mL nalidixic asit içeren levhalar üzerine 2 mL dışarı tarafından seçildi. MG1655 tek bir klonu alıcı zorlanma olmak nalidixic aside dayanıklı seçilmiş. Ayrıca, alıcı zorlanma lambda pir negatif, yukarıda açıklandığı gibi olması gerekir.
Genel bakış: bakteriyel konjugasyon yerini almıştır ve pJA1 plazmid donör zorlanma alıcı zorlanma taşındı sonra IPTG ek olarak medya IPTG indüklenebilir kontrolü altında olduğunu tnp gen ifade neden lacIq/Ptac organizatörü (şekil 1). PJA1 üzerinde tnp gen ekleme daha düşük bir frekans sıcak noktalar6,10,11, sahip bir mutant transposase var. Ek ve indüksiyon IPTG ile transposon aktif ve rastgele genom eklenmiş. Plazmid lambda pir-alıcı zorlanma muhafaza ve kaybolur.
Burada açıklanan iletişim kuralı yoğun ekleme Kütüphane yapımı için izin verir. Bu yöntemi bir transposon kitaplığı oluşturma kullanma altındaki Kültür Cilt65 mL 2 x 10 üzerinden5 benzersiz transposon mutantlar ile olanak sağlar. Bunu gerçekleştirmek nispeten kolaydır, reaktifler en temel Mikrobiyoloji laboratuarlarında kullanılabilir kullanır ölçeklenebilir ve az pahalı ekipman veya elektroporasyon cuvettes gibi sarf malzemeleri şekilde gerektirir.
Bu yöntemin önemli bir yararı teorisinde, kullanıcı geniş enlem enterobacterial alıcı suş seçiminde, olmasıdır. Bu kağıt, diğerlerinin yanı sıra11, E. coli pJA1 plazmid Shigella flexneri6 ve Salmonella enterica gibi diğer enterobacterial alıcı türleri ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır ancak alıcı bir yük kullanın serovar Typhimurium süzün SL134410. Teorik olarak, pJA1 (oriR6Kγ) çoğaltmasında γ kökeni bu plazmid alıcı zorlanma olduğunu sağlayan bir geniş ana Aralık19, devam etmesine izin verir pır +. Son zamanlarda, yeni yöntemler pır + enterobacterial suşları20ek bir esneklik veren, bir dizi yapımı için izin tarif edilmistir. Buna ek olarak, pJA1 içinde RP4 plazmid300 baz çifti çete bölgesinden bu plazmid Konjügatif transferini gram negatif bakteri suşları19geniş bir yelpazesi için sağlar. Çeşitli şartlar yerine getirildiği sürece Basitçe söylemek gerekirse, bu yöntem teorik olarak alıcı suşları, çeşitli ile kullanılabilir: piryük olduğunu + ve sefaloridin dışında ve donör zorlanma dışında bir antibiyotik direnci ile işaretlenir.
Protokol kritik bir adımda dışarı adım 4.1 plaka hücrelerinin doğru sayısı tahmini yaparken yatıyor. Koloniler çok yakından aralıklı, plaka üzerinde besinler için rekabet ve daha az uygun mutant outcompeted. Bu mutant toplam sayısı bir azalma neden olabilir. Alternatif olarak, koloniler aralıklandırılmış Eğer çok çok ayrı plaka üzerinde çok az kolonileri olacak ve büyük bir kütüphane ulaşmak için gereken Ağar kaplamalar toplam sayısı külfetli olur. Bu nedenle, plaka başına koloni numara açısından doğru dengeyi elde etmek önemlidir.
Listelenen adımları açıklandığı gibi çalıştığınızdan emin olmak için iletişim kuralında denetimleri gerçekleştirmek önemlidir. Özellikle, nalidixic asit donör zorlanma karşı karşı bir seçim olarak kullanırken, negatif donör denetim plakaları kolonileri ücretsizdir emin olmak önemlidir. Nalidixic asit, yanlış pozitif verimli spontan direnç oranı düşük (yaklaşık 1 x 10-10)21 olabileceğinden bu. Tipik olarak, yaklaşık 2 x 10-4 19konjügasyon ve devralınmasına oranıdır. Bu nedenle, fiil ve devralınmasına büyüklükte birkaç emir nalidixic asit spontan direnç hızından daha büyük oranıdır. Bu nedenle, doğru yansıtılması olaylarına göre yanlış pozitif oranı çok düşüktür ve protokol çalışırken ihmal edilebilir sayılır. Ancak, konjugasyon veya hukuka oranları önemli ölçüde azalır, (den düşük çiftleşme verimliliği ve/veya transposase gen IPTG ile indüksiyon eksikliği) ve iletişim kuralını ölçekli Eğer bu, o zaman yanlış pozitif sayı için telafi etmek için (Bu klonlar eklenen transposon var mı) da artırabilir.
Adımları 3.2 ve 3.10 kuluçka zamanlarında bazı değişiklikler yapılabilir. Konjugasyon 6 h için gerçekleşmesi gereken 3.2 Birleşik adım, ama deneyim, bu saat adım olabilir (Yani, 4-7 h) sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden farklı. Ayrıca, 3.10 adımda koloniler agar Tabaklarda inkübe süreyi da ayarlanabilir. Bu alıcı zorlanma zaman ya da büyüme oranını iki katına ortalama bağlı olarak farklı olabilir. Buna ek olarak, deneyim, 18 h çeşitli koloni boyutları, kitaplığa farklı uygunluk gösteren vermiştir. Ancak, büyük ölçüde azaltılmış fitness ile kolonileri büyümek için daha uzun sürebilir ve bu nedenle 18 h sonra görünür olmayabilir. Bu yöntem son derece düşük fitness klonları bulmak için kullanılıyorsa uzun kuluçka süreleri ve daha az kolonileri kalabalık (Yani, 48 h, 50-300 kolonileri) azaltmak için plaka üzerinde kullanılabilir.
Bu yöntemin ek tuzaklar zaten sefaloridin dayanıklıdır alıcı bir yük kullanmak mümkün değil içerir. PJA1 plazmid sefaloridin direnç işaretleyicisinde bu engeli aşmak için kloramfenikol direnç gibi alternatif bir seçilebilir marker için takas mümkün olabilir. Teorik olarak, bu alıcı bir gerginlik, Ampisilin dayanıklıdır kullanmak mümkün, dikkati de olabilir, pJA1 plazmid Ampisilin direnç işaretçiyi içeren transpozisyonu kısa bir süre sonra kaybolur.
Yoğun transposon kütüphane seçim genetik arka planda oluşturulmasını birçok aşağı akım uygulama için potansiyel olarak avantajlıdır. Örneğin, bir yoğun transposon Kütüphane auxotrophic mutantlar yineleme kaplama22 kullanarak veya bir enfeksiyon1,2kurulması kusurlu mutantlar tanımlamak için kullanılabilir. Daha yakın zamanlarda, DNA sıralama maliyeti düşmüş ve sonraki nesil sıralama gibi yeni teknolojileri hale gelmiş gibi sıradan, transposon kütüphaneler derin DNA sıralama ile gen zorunluluk, gen işlevi, bir anlayış kazanmak için daha önce kullanılmış ve genetik etkileşimler. Bu yöntemlerden bazıları 23 ‘ te incelenir ve transposon Yönetmen: ekleme site sıralama (TraDIS), transposon sıralama (Tn-seq), derin sıralama (sayısı) ve ekleme sıralama (izleme yüksek üretilen iş ekleme gibi yöntemleri içerir INSeq). Aşağı akım yöntemlerin yoğun transposon ekleme kitaplıklar inşaat üzerinde güveniyor. Diğer vektörel çizimler için belirli aşağı akım yöntemlerin kullanılması gerekebilir, burada açıklanan protokolü takip etmek en göze çarpan yordam puanları genel olarak verir.
The authors have nothing to disclose.
George Kilisesi laboratuvar pJA1 plazmid tür hediye için teşekkür ederiz. Ben Fabienne Hamburger ve Alex Boehm Urs Jenal laboratuarından Biozentrum Basel, bakteriyel konjugasyon yardım ve BW20767 zorlanma sağlamak için teşekkür ederiz. Ayrıca yararlı düzenlemeler için Olin Silander teşekkür ederiz. Bu araştırma için fon fon Massey Üniversitesi Yeni Zelanda ve sistemleri biyoloji (proje “Savaş Dirk Bumann layık X”) İsviçreli girişimi tarafından Basel, İsviçre Üniversitesi sağlandı.
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) | Millipore | HAWP02500 | Alternatively blotting paper can be used (listed below) |
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper | GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm | 3030-917 | Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above) |
Metal Forceps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | MURRE009/01 | |
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume, 12.5 mL working volume. | Interlab New Zealand | 2303-1090 | |
Sterile glass spreaders | VWR/Global Science New Zealand | NZNZSPREADER | Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below) |
Sterile glass beads | VWR/Global Science New Zealand | HERE1080603 | Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above) |
Nalidixic acid (optional) | GoldBio.com | N-015-250 | |
Ampicillin sodium salt BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA0839.0025 | prepare according to manufacturer recommendation |
Kanamycin sulfate BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA1493.0010 | |
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | Thermofisher New Zealand | FMTR0393 | |
Difco Agar granulated | Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand | 214530 | |
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) | Thermofisher | 12795-084 | |
Glycerol bidistilled 99,5 % | VWR/Global Science New Zealand | VWRC24388.320 | |
15 ml polypropelene sterile conical vials | VWR/Global Science New Zealand | CORN430791 | |
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable | VWR/Global Science New Zealand | AXYGMCT-175-C | |
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | BDAA352070 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Incubator at 37C | |||
Autoclave for sterilizing media |