Présenté ici est une méthode simple pour créer une bibliothèque d’insertion haute densité transposon dans Escherichia coli ou Shigella flexneri utilisant la conjugaison bactérienne. Ce protocole permet la création d’une collection de centaines de milliers de mutants uniques chez les bactéries par l’insertion de génomique au hasard d’un transposon.
Mutagénèse du transposon est une méthode qui permet de perturbation génétique par l’insertion de génomique au hasard d’un fragment d’ADN appelé transposon. Le protocole ci-dessous décrit un procédé de transfert de haut rendement entre souches bactériennes d’un plasmide hébergeant un transposon contenant un marqueur de résistance kanamycine. La transposase plasmide est codée par un gène variant PNT qui insère les transposons dans le génome de la souche réceptrice avec partialité insertion très faible. Cette méthode permet ainsi la création de grandes bibliothèques mutants dans lequel les transposons ont été insérés dans des positions de génomiques uniques dans une souche de bactéries Escherichia coli ou de Shigella flexneri . Grâce à la conjugaison bactérienne, par opposition à d’autres méthodes telles que l’électroporation ou transformation chimique, les grandes bibliothèques avec des centaines de milliers de clones uniques peuvent être créés. Cela donne des bibliothèques d’insertion haute densité, avec insertions se produisant aussi souvent que chaque 4-6 paires de bases dans les gènes non essentiels. Cette méthode est supérieure aux autres méthodes, car il permet d’utiliser une méthode peu coûteux, facile à utiliser et une efficacité élevées pour la création d’une bibliothèque d’insertion de transposon dense. La bibliothèque de transposon peut être utilisée dans des applications en aval comme le transposon séquençage (Tn-Seq), de déduire des réseaux d’interactions génétiques, ou plus simplement, en mutation (avant génétique) écrans.
La création de bibliothèques de mutagénèse transposon chez les bactéries est utile pour une grande variété d’applications, allant de découvertes de gènes de virulence des bactéries pathogènes1,2, à l’étude des gènes essentiels3, 4 , 5 , 6, à l’identification des interactions génétiques réseaux7,8,9. Critique de ces études est la possibilité de créer une grande bibliothèque de mutants. L’utilisation de transposons (courts fragments d’ADN qui insèrent aléatoirement dans un génome) est un moyen simple de perturber la fonction du gène, car l’insertion d’un transposon dans le cadre de lecture ouvert ou de la région de régulation d’un gène va souvent perturber la fonction ou l’expression du gène.
Présentée ici est une méthode pour la création d’une bibliothèque de transposon dans e. coli ou S. flexneri de conjugaison bactérienne, utilisez le plasmide pJA110. Il y a deux principaux avantages à l’utilisation de ce plasmide. Le premier avantage est que la variante de la transposase Tn10 exprimée à partir du plasmide pJA1 est inductible et insertion faible biais11,12, ce qui signifie que le transposon intégrera au hasard dans le génome lorsque isopropylique Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) est ajouté à la presse. Le transposon contient un marqueur de résistance kanamycine, permettant la sélection de mutants avec les inserts de transposons dans le chromosome de la souche réceptrice. Le deuxième avantage du plasmide pJA1 est qu’elle contient une origine mutant R6K de réplication. L’origine de mutant R6K de réplication nécessite le gène de pir lambda dans l’ordre pour le maintien du plasmide13. Comme le plasmide ne peut pas répliquer en variétés de pir , il se perdra dans la souche réceptrice (Figure 1). Cela garantit que Tn10 transposase est retiré de la cellule et qu’il n’est plus actif, de réduire davantage les mutations après l’événement initial de transposition.
L’utilisation de la conjugaison bactérienne pour déplacer le plasmide pJA1 de la souche de donateur à la souche réceptrice est avantageuse pour plusieurs raisons. Conjugaison est simple et peu coûteux à réaliser et n’a pas besoin des équipements spéciaux comme un électroporateur. De plus, l’efficacité élevée de la conjugaison bactérienne permet une très grande bibliothèque (> 2 x 105 insertions unique) à atteindre avec seulement quelques millilitres (mL) d’une nuit de culture bactérienne6. Le processus prend environ deux heures de temps pratique avec temps d’incubation et la croissance des bactéries. Langridge et al. 14 a fait état de 130 électroporations pour créer une bibliothèque de mutagénèse transposon d’une taille similaire à celle décrite ici8, qui est obtenue grâce à une conjugaison unique. L’utilisation de 130 électroporations nécessite du travail intensif et fastidieuse préparation de cellules electrocompetent et l’utilisation de nombreux matériaux coûteux (p. ex., des cuvettes d’électroporation), pour un coût de plus de 1 000 $ US en consommables seuls. Autres études10 ont utilisé des méthodes similaires, mais avec différentes souches bactériennes et réalisé beaucoup de plus petites tailles de bibliothèque (5 x 104 unités formant des colonies) que rapportés ici.
Notes sur la souche de donateurs : la souche de donneur utilisée ici est la souche e. coli BW2076715 contenant le pJA1 transposon plasmide16. BW20767 de souche peut conjuguer à d’autres souches, qui procède au transfert du plasmide pJA1 très efficace. En outre, ce qui est important, BW20767 est lambda pir +. Tel que mentionné précédemment, le plasmide pJA1 ne peut être maintenue dans les souches contenant le gène de pir lambda. Cette souche est kanamycine et ampicilline résistante. Le plasmide pJA1 contient le marqueur de résistance ampicilline, et un marqueur de résistance kanamycine est contenu dans le transposon. Cette souche est cultivée avec sélection sur le plasmide utilisant ampicilline à 100 µg/mL. Il est également intéressant de noter que les autres souches hébergeant constitutivement exprimé transposase gènes sont connus pour être instable et alors que la transposase utilisé ici est sous inductible de contrôle, il reste un risque faible d’expression qui fuit. Pour cette raison, il est suggéré que le passage de cette souche doit être minimisé et une strie fraîche doit provenir d’une culture congelée pour chaque nouvelle préparation de bibliothèque. La souche de donneur utilisée ici est disponible dans notre laboratoire sur demande.
Notes sur la souche du destinataire : la souche réceptrice peut être une souche de choix, tels que les souches de laboratoire K12-dérivé d’e. coli ou souches de S.flexneri (voir aussi, la Discussion). La souche réceptrice doit avoir un marqueur de résistance aux antibiotiques supplémentaires qui n’est pas la résistance à la kanamycine, afin que la souche de donateurs peut être sélectionnée contre. Pour la souche réceptrice, une souche MG1655 d’e. coli est utilisée ici avec une mutation spontanée introduit l’acide nalidixique. Le mutant de l’acide nalidixique spontanée a été sélectionné par électrodéposition 2 ml de culture nuitée dans 200 µL d’extraits sur des plaques contenant de l’acide nalidixique à 30 µg/mL. Un seul clone de MG1655 a été sélectionné qui était résistant à l’acide nalidixique pour devenir la souche réceptrice. En outre, la souche réceptrice doit être lambda pir négatif, tel que décrit ci-dessus.
Vue d’ensemble : Une fois que la conjugaison bactérienne a eu lieu et le plasmide pJA1 a déménagé de la souche de donneur dans la souche réceptrice, l’ajout d’IPTG aux médias va entraîner l’expression du gène PNT , qui est sous le contrôle de l’IPTG inductible lacIq/Ptac promoteur (Figure 1). Le gène de la PNT sur pJA1 est une transposase mutante qui a une faible fréquence d’insertion aux points chauds6,10,11. Ajout et induction avec IPTG, le transposon est activé et inséré au hasard dans le génome. Le plasmide ne peut être maintenu dans la souche de pir-recipient lambda et se perd.
Le protocole décrit ici permet la construction d’une bibliothèque d’insertion dense. Cette méthode permet la création d’une bibliothèque de transposon avec plus de 2 x 105 mutants de transposon unique à l’aide de moins de 5 mL de culture volume6. Il est relativement facile à exécuter, utilise des réactifs disponibles dans les laboratoires de microbiologie plus élémentaires, est évolutif et nécessite peu de matériel coûteux ou consommables tels que les cuves d’électroporation.
Un avantage important de cette méthode est que, en théorie, l’utilisateur a toute latitude dans le choix des souches réceptrices entérobactéries. Ce papier, ainsi que d’autres11, utiliser des e. coli comme une souche réceptrice, toutefois le plasmide pJA1 a été utilisé avec succès avec d’autres espèces de destinataire entérobactéries comme Shigella flexneri6 et Salmonella enterica souche de sérotype Typhimurium SL134410. L’origine γ de réplication (oriR6Kγ) en pJA1 permet en théorie, ce plasmide à être maintenu dans un large spectre d’hôtes rang19, ce qui permet que la souche réceptrice est pir +. Récemment, nouvelles méthodes ont été décrites qui permettent pour la construction de la pir + dans une variété de souches entérobactéries20, donnant plus de souplesse. En outre, la région de300 paires de bases mob du plasmide RP4 dans pJA1 permet le transfert conjugatif de ce plasmide à un large éventail de gram négatif de souches bactériennes19. Autrement dit, cette méthode pourrait théoriquement être utilisée avec une variété de souches réceptrices, aussi longtemps que plusieurs conditions soient remplies : la souche est pir+ et est munie d’une résistance aux antibiotique autres que kanamycine et autres que la souche du donneur.
Une étape cruciale dans le protocole se trouve à estimer le nombre adéquat de cellules à plaque dehors au point 4.1. Si les colonies sont espacés de trop près, ils se disputent les nutriments sur la plaque et moins fit des mutants sont surpassés. Cela peut conduire à une réduction du nombre total de mutants. Sinon, si les colonies sont espacées trop éloignés, il y aura trop peu de colonies sur la plaque, et le nombre total de boîtes de gélose nécessaires pour atteindre une grande bibliothèque devient lourd. Par conséquent, il est important d’atteindre le juste équilibre en termes de nombre de colonies par boîte.
Il est important d’effectuer les contrôles énumérés dans le protocole pour s’assurer que les étapes fonctionnent comme décrit. Notamment, lorsque vous utilisez l’acide nalidixique comme une sélection de lutte contre la souche du donneur, il est important de s’assurer que les plaques de contrôle négatif donneur sont libres des colonies. C’est parce qu’il peut y avoir un taux faible (environ 1 x 10-10)21 de résistance spontanée à l’acide nalidixique, ce qui donne de faux positifs. En général, le taux de conjugaison et de transposition est environ 2 x 10-4 19. Par conséquent, le taux de conjugaison et de transposition est plusieurs ordres de grandeur plus grand que le taux de résistance spontanée à l’acide nalidixique. Par conséquent, le taux de faux positifs par rapport aux événements de transposition vrai est très faible et jugé négligeable lorsque le protocole est en marche. Toutefois, si le taux de conjugaison ou de transposition sont considérablement réduits, (à partir de faible efficacité accouplement et/ou au manque d’induction de la gène de la transposase avec IPTG) et le protocole est entartré pour compenser cela, alors que le nombre de faux positifs (clones qui n’ont pas le transposon inséré) peut également augmenter.
Certaines modifications peuvent être effectuées à l’époque d’incubation en étapes 3.2 et 3.10. Étape de 3,2 États conjugaison devrait survenir pendant 6 h, mais d’après notre expérience, cette étape de temps peut être varié (c.-à-d., 4-7 h) sans changer les résultats significativement. En outre, à l’étape 3.10, la longueur du temps, que les colonies sont incubés sur les géloses peut également être ajustée. Cela peut varier selon la moyenne doubler le taux de temps ou de la croissance de la souche réceptrice. En outre, dans notre expérience, 18 h a produit une variété de tailles de colonie, indiquant une bibliothèque d’aptitude diverse. Cependant, colonies avec remise en forme très réduite peuvent prendre plus de temps pour se développer et donc peut-être pas visibles après 18 h. Si cette méthode est utilisée pour trouver des clones d’aptitude extrêmement réduite, des temps d’incubation plus longues et moins de colonies sur la plaque afin de réduire le surpeuplement (p. ex., 48 h, 50-300 colonies) peuvent être utilisés.
Des pièges supplémentaires de cette méthode sont qu’il n’est pas possible d’utiliser une souche réceptrice qui est déjà résistant à la kanamycine. Il peut être possible de permuter le marqueur de résistance kanamycine dans le plasmide pJA1 pour un autre marqueur de sélection, telles que la résistance de chloramphénicol à surmonter cet obstacle. Il peut également être intéressant de noter que, en théorie, il est possible d’utiliser une souche réceptrice ampicilline résistante, comme le pJA1 plasmide contenant le marqueur de résistance ampicilline est perdue peu de temps après la transposition.
La création d’une bibliothèque de transposon dense dans le bagage génétique de choix est potentiellement avantageuse pour de nombreuses applications en aval. Par exemple, une bibliothèque de transposon dense pourrait être utilisée pour identifier les mutants auxotrophes utilisant réplique placage22 ou pour identifier des mutants qui sont défectueux à établir une infection1,2. Plus récemment, comme les coûts de séquençage de l’ADN ont diminué et les nouvelles technologies comme le séquençage de la génération suivant sont devenus monnaie courante, bibliothèques de transposon ont été utilisés avec profond séquençage de l’ADN pour avoir un aperçu essentiel de gène, la fonction du gène et génétiques interactions. Certaines de ces méthodes sont passées en revue dans 23 et comprennent des méthodes telles que le séquençage de site dirigée transposon insertion (TraDIS), séquençage des transposons (Tn-seq), haut-débit insertion suivi par séquençage en profondeur (HITS) et insertion séquençage ( INSeq). Toutes ces méthodes en aval reposent sur la construction des bibliothèques d’insertion transposon dense. Alors que les autres vecteurs peuvent doivent être utilisées pour des méthodes particulières en aval, le protocole décrit ici donne un aperçu des points saillants procédures à suivre.
The authors have nothing to disclose.
Je remercie le laboratoire d’église de George pour le gentil cadeau du plasmide pJA1. Je remercie Fabienne Hamburger et Alex Boehm du labo Jenal Urs au Biozentrum à Bâle pour aide à la conjugaison bactérienne et pour fournir la souche BW20767. Je remercie également Olin Silander pour modifications utiles. Cette recherche a été financé par des fonds de l’Université Massey en Nouvelle-Zélande et de l’Initiative Suisse en biologie des systèmes (projet « Bataille X » décerné à Dirk Bumann) à l’Université de Bâle, Suisse.
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) | Millipore | HAWP02500 | Alternatively blotting paper can be used (listed below) |
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper | GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm | 3030-917 | Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above) |
Metal Forceps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | MURRE009/01 | |
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume, 12.5 mL working volume. | Interlab New Zealand | 2303-1090 | |
Sterile glass spreaders | VWR/Global Science New Zealand | NZNZSPREADER | Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below) |
Sterile glass beads | VWR/Global Science New Zealand | HERE1080603 | Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above) |
Nalidixic acid (optional) | GoldBio.com | N-015-250 | |
Ampicillin sodium salt BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA0839.0025 | prepare according to manufacturer recommendation |
Kanamycin sulfate BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA1493.0010 | |
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | Thermofisher New Zealand | FMTR0393 | |
Difco Agar granulated | Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand | 214530 | |
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) | Thermofisher | 12795-084 | |
Glycerol bidistilled 99,5 % | VWR/Global Science New Zealand | VWRC24388.320 | |
15 ml polypropelene sterile conical vials | VWR/Global Science New Zealand | CORN430791 | |
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable | VWR/Global Science New Zealand | AXYGMCT-175-C | |
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | BDAA352070 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Incubator at 37C | |||
Autoclave for sterilizing media |