Эффективный скрининг протокол представлен для идентификации малых молекул, которые способствуют астроглиальных дифференцировки стволовых клеток глиобластомы (GSCs). Assay основан на которой выражение расширенной GFP (eGFP) управляется человека промоутер СВМС репортер дифференцировки стволовых клеток.
Глиобластома (GBM) является наиболее распространенным и наиболее смертоносных первичного мозга опухоль в взрослых, вызывая примерно 14 000 смертей каждый год в США в одиночку. Медиана выживаемости после диагностики находится менее чем в 15 месяцев с максимальной хирургической резекции, радиации и Темозоламид химиотерапии. Проблемы, присущие в разработке более эффективных методов лечения GBM стали все более очевидными и включить его непоколебимой инвазивность, его устойчивость к стандартной процедуры, ее генетических сложности и молекулярных адаптируемость и субпопуляций GBM клетки с фенотипические сходство с обычной стволовых клеток, далее именуемая глиобластома стволовых клеток (GSCs). Потому что GSCs необходимы для роста опухоли и прогрессии, на основе дифференциации терапия представляет механизм эффективным методом лечения для этих неизлечимой новообразования.
Следующий протокол описывает коллекцию процедур установить высокую пропускную способность, скрининг платформы, направленные на выявление малых молекул, которые способствуют GSC астроглиальных дифференцировки. Ядром системы является конструкцией репортер дифференциация глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Протокол содержит следующие общие процедуры: (1) создание РКГ дифференциация репортер линии; (2) тестирование/Проверка актуальности репортер GSC self обновление/колониеобразования емкости; и (3) высокой емкости цитометрии наркотиков скрининг.
Скрининг платформа обеспечивает простой и недорогой подход для выявления малые молекулы, которые способствуют GSCs дифференцировки. Кроме того использование библиотек FDA утвержденных препаратов имеет потенциал для идентификации агентов, которые можно многократно использовать более быстрыми темпами. Кроме того методы лечения, которые способствуют дифференцировки стволовых клеток рака, как ожидается, синергетически работать с текущей «стандарт медицинской помощи» терапии, которые показали и ликвидации прежде всего более дифференцированной раковые клетки.
Недавние исследования показали, что опухоли содержат небольшой численностью населения клеток, Рак стволовых клеток (ПОК) или инициирование опухоли клетки, которые отвечают за прогрессии опухоли, метастазы и устойчивость к химио – и радио терапии 1, 2. наличие раковых стволовых клеток и их более дифференцированной потомков в опухоли считается важным фактором содействия внутриопухолевых неоднородность и таким образом является главным препятствием в лечении рака3. Опухоли клеток иерархии, представленной теории стволовых клеток рака, вдохновило развитие новых стратегий для лечения рака 4. Один из подходов для ориентации Рак стволовых клеток заключается в выявлении и подавляют сигнальных путей, которые известны как требуется во время эмбрионального развития пораженного органа. Действительно мы и другие ранее опубликовали несколько документов, описывающих текущие требования нервные стволовых клеток соответствующие сигнальные пути Еж Соник и паз, глиобластома5,6,7. Эта работа помогла застывающих обоснование несколько GBM клинических испытаний. Второй подход для ориентации Рак стволовых клеток заключается в содействии их дифференциация. Этот подход получил много поддержки из-за благоприятные результаты доклинических и клинических исследований в лечении острого promyelocytic лейкоза с ретиноевой кислоты (ATRA, аналог витамина А). Здесь был найден ATRA удалить блок созревания и поощрять дифференциацию клеток рака8. Совсем недавно Пикирилло и коллеги элегантно показали, что BMP-4 вызывает дифференцировку РКГ в астроциты с значительным анти GBM эффекты in vitro и in vivo9.
Основания для нынешнего исследования основана на подходе «обратный инжиниринг» для ориентации GSCs. Учитывая огромные неоднородность, присутствующие в GBM и с плохой дифференциацией, будучи одним из отличительных признаков рака, мы спросили, если мы могли бы содействовать более благоприятные фенотип – дифференциация в экзоцитоз подобное состояние. Здесь мы не имеют предварительных знаний о сигнальных путей, которые поддерживать GSCs в данной опухоли образец, но скорее стремимся достичь желаемого фенотип (например СВМС позитивности).
В настоящем докладе описываются процедуры, используемые для установления GSC дифференциация репортер линии от трансдукции GSC-обогащенный культур GSC клонового отбора. Глиобластома нейросферы линии, используемые были созданы в лаборатории профессора Анджело Вескови от пациентов с диагнозом первичной глиобластомы в госпитале San Raffaele – Милан, Италия. Эти линии были широко изучены в ряде публикаций 6,10,11,12,13,14. Настоятельно рекомендуется, что люди, которые заинтересованы в осуществлении этих методов в их лаборатории определяют актуальность репортер способность самообновления Рак стволовых клеток в клетки, они планируют изучать (это верно для любого репортер). Подробный протокол для одного в vitro колониеобразования анализов в поле предоставляется для достижения этого15,16. Наконец подробный протокол описания использования дифференциация репортер линий на экране наркотиков цитометрии основе предоставляется в конце. Следует отметить аналогично системе дифференциации астроглиальных, описанных здесь, мы успешно создали и проверены линии репортер GSC интеграции репортер (нейрональных дифференциации) MAP2:GFP. Таким образом, методологии описывают в этом бумаги могут быть применены для изучения клеточной дифференцировке в различные ячейки.
Некоторые из фигур в настоящем докладе можно найти в недавней публикации: «атракурия бесилат других нервно блокирующих агентов астроглиальных дифференциация и содействия разрушающим стволовых клеток глиобластомы18.
Хотя большинство предыдущих исследований GSCs, сосредоточены главным образом на маркеры, которые определяют их в этом исследовании мы решили взять обратный подход. Мы ориентируемся прежде всего на дифференцированной потомков, порожденных GSCs (например, клетки, выражая астроглиальных и н…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа частично поддерживается R01CA187780 низ.
ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
96 well plate | Falcon | 353072 | |
Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |