פרוטוקול הקרנה יעילים מוצג לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים astroglial התמיינות בתאי גזע glioblastoma (GSCs). וזמינותו מבוסס על עיתונאי התמיינות תאי גזע לפיה הביטוי GFP משופרת (eGFP) הוא מונע על ידי האמרגן GFAP האנושית.
גליובלסטומה (GBM) הוא הגידול במוח העיקרי הנפוץ ביותר וקטלני ביותר אצל מבוגרים, גורם בערך 14,000 מקרי מוות בכל שנה בארצות הברית לבדה. חציון ההישרדות לאחר אבחון הוא פחות מ-15 חודשים עם כימותרפיה כריתה, קרינה, temozolomide כירורגית מקסימלי. האתגרים הכרוכים בפיתוח טיפולים יעילים יותר GBM הפכו ליותר ויותר ברורה, כולל invasiveness הלא מתפשר שלו, עמידותו טיפולים סטנדרטיים, שלה המורכבות הגנטית הסתגלות מולקולרית ואת subpopulations של GBM תאים עם דמיון פנוטיפי לתאי גזע נורמלי, במסמך זה מתייחסים כאל תאי גזע glioblastoma (GSCs). בגלל GSCs נדרש עבור התקדמות וצמיחה של גידול, טיפול המבוסס על בידול מייצג של קיימא לטיפול אפנות עבור אלה neoplasms חשוכת מרפא.
הפרוטוקול הבא מתאר אוסף של הליכים להקים על תפוקה גבוהה הקרנת פלטפורמה מכוון הזיהוי של מולקולות קטנות המקדמים GSC astroglial בידול. הליבה של המערכת הוא חלבון חומצי fibrillary (GFAP) גליה הבידול כתב-בונה. הפרוטוקול מכיל כללי ההליכים הבאים: (1) הקמת קווי הכתב של בידול GSC; (2) בדיקה/אימות הרלוונטיות של הכתב קיבולת העצמי-חידוש/clonogenic GSC; (3) קיבולת גבוהה cytometry זרימה מבוסס והתרופות הקרנה.
פלטפורמת ההקרנה מספקת גישה פשוטה וזולה לזיהוי מולקולות קטנות המקדמים GSCs בידול. יתר על כן, ניצול של ספריות של תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA מחזיק את פוטנציאל הזיהוי של סוכנים ניתן יהיה לשנות את ייעודו במהירות רבה יותר. כמו כן, טיפולים המקדמים התמיינות תאי סרטן צפויים לפעול בסינרגיה עם טיפולים שוטפים “סטנדרט של טיפול”, אשר הוכחו היעד ולחסל התאים הסרטניים הבדיל יותר בעיקר.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גידולים מכילים אוכלוסיה קטנה של תאים, כינה את תאי הגזע הסרטניים (CSCs) או ייזום-גידול תאים, אשר אחראים על התקדמות הגידול, גרורות, עמידות בפני כימותרפיה-רדיו-טיפולים אלטרנטיביים 1, 2. הנוכחות של תאי הגזע הסרטניים, שלהם progenies הבדיל יותר בתוך גידולים נחשב גורם חשוב בקידום intratumoral הטרוגניות, ובכך מייצג משוכה גדולה בטיפול סרטן3. גידול תאים היררכיה, שמספקת התיאוריה תאי סרטן, נתן השראה לפיתוח אסטרטגיות חדשות לטיפול סרטן 4. גישה אחת הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לזהות ומעכבות איתות המסלולים הידועים להידרש במהלך התפתחות של האיבר המושפע. אכן, אנחנו ואחרים בעבר פרסמו מסמכים מרובים המתארת את הדרישה מתמשך תאי גזע-רלוונטי איתות מסלולים עצביים סוניק הקיפוד, דרגה ב גליובלסטומה5,6,7. עבודה זו סייעה תוך שהשרף מתהווה הרציונל מספר ניסויים קליניים GBM. הגישה השניה הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לקדם את הבידול שלהם. גישה זו קיבלה הרבה תמיכה בשל תוצאות חיוביות קליניים וקליניים בטיפול לוקמיה פרומיאלוציטית חריפה עם חומצות retinoic (ATRA, אנלוגי של ויטמין A). כאן ATRA נמצאה כדי להסיר את החסימה ההבשלה ולקדם סרטן התא בידול8. לאחרונה, Piccirillo ועמיתיו באלגנטיות הראו כי BMP-4 מקדמת GSC בידול לתוך האסטרוציטים משמעותית אנטי-GBM אפקטים במבחנה , ויוו9.
הרציונל שבבסיס המחקר הנוכחי מבוסס על גישה “הנדסה הפוכה” עבור מיקוד GSCs. בהתחשב את הטרוגניות עצום נוכח ב- GBM, עם בידול המסכן של גולת הכותרת של סרטן, שאלנו אם אנחנו יכולים לקדם את הפנוטיפ למענך – בידול לתוך מצב דמוי אסטרוציט. כאן, אין לנו ידיעה מוקדמת מסלולים איתות לשמור על GSCs הדגימה גידול נתון אך מעדיף מכוונים להשיג הפנוטיפ הרצוי (למשל GFAP חיוביות).
הדו ח מתאר את ההליכים המשמשים ליצירת GSC בידול כתב-קווים מן התמרה חושית של תרבויות מועשר-GSC GSC שבטים. הקווים neurosphere גליובלסטומה המשמשים הוקמו במעבדה של פרופסור אנג’לו Vescovi של חולים עם אבחנה של גליובלסטומה ראשי בבית החולים סן רפאלה – מילאנו, איטליה. קווים אלה נחקרו בהרחבה מספר פרסומים 6,10,11,12,13,14. מומלץ מאוד כי אנשים המעוניינים ביישום טכניקות אלה במעבדה שלהם לקבוע את הרלוונטיות של הכתב קיבולת התחדשות עצמית תאי סרטן בתאים הם מתכננים ללמוד (זה נכון גם לגבי שום כתב). פרוטוקול מפורט לאחד במבחנה clonogenic מבחני מקובלים בתחום מסופק כדי להשיג את זה15,16. לבסוף, פרוטוקול מפורט המתאר את הניצול של בידול הכתב-בשורות מסך סמים מבוסס cytometry זרימה מסופק בסוף. ראוי לציין, באופן דומה למערכת בידול astroglial המתוארים כאן, יש לנו בהצלחה הוקמה ואנו לאמת GSC כתב שורות שילוב של הכתב (בידול עצביים) MAP2:GFP. לכן, למתודולוגיות לתאר זה נייר ניתן להחיל ללמוד התמיינות לתוך שושלות תאים שונים.
כמה מן הדמויות בדו”ח זה ניתן למצוא בפרסום האחרונים:”Atracurium Besylate סוכנים אחרים חסימת עצב-שריר לקדם astroglial בידול, לרוקן glioblastoma תאי גזע18.
ואילו רוב המחקרים הקודמים של GSCs התמקדה בעיקר סמני שמגדירים אותם, במחקר זה החלטנו לנקוט בגישה הפוכה. אנו מתמקדים בעיקר progenies הבדיל שנוצר על ידי GSCs (למשל, תאים לבטא astroglial סמנים עצביים). כאן אנחנו מדגימים את הניצול של תרופה מבוססת תא תפוקה גבוהה מערכת, אשר מבוססת על הביטוי תלוי-יזם GFAP האנושי GFP ה…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו חלקית בתמיכתם NIH R01CA187780.
ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
96 well plate | Falcon | 353072 | |
Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |