Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung
Summary
Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.
Abstract
Jahrelang wurden Unterschiede zwischen skelettartigen Muskel Fasertypen am besten durch Myosin-ATPase Färbung sichtbar gemacht. Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp entwickelt. Typ I, Typ IIA, Typ IIX und Typ IIB Fasern jetzt mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil identifiziert werden können; manuelle Auswertung dieser Daten kann jedoch langsam und unten-rechts langweilig. Schnelle, präzise Bewertung der Fasertyp Zusammensetzung und Morphologie ist in dieser Hinsicht ein sehr wünschenswert Werkzeug. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für State-of-the-Art immunhistochemische Färbung des MyHCs in Gefrierschnitte gewonnenen Maus Megalosauridae Muskel im Konzert mit einem neuartigen semi-automatischen Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie beschleunigt. Wie erwartet, Musculus soleus angezeigt Färbung für Typ I und Typ IIA Fasern, aber nicht für Typ IIX oder Typ IIB Fasern. Auf der anderen Seite der Tibialis anterior-Muskel setzte sich überwiegend aus Typ IIX und Typ IIB Fasern, ein kleiner Bruchteil der Typ IIA Fasern und wenig oder gar keine Typ-I-Fasern. Mehrere Bildtransformationen wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit Karten zum Zwecke der Messung der verschiedenen Aspekte der Faser Morphologie (d.h.Querschnittsfläche (CSA), maximale und minimale Feret Durchmesser) zu generieren. Die Werte für diese Parameter dann mit manuell erhaltenen Werten verglichen wurden. Keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Modi der Analyse im Hinblick auf CSA, maximal- bzw. Minimalwert Feret Durchmesser beobachtet wurden (alle p > 0,05), die Genauigkeit unserer Methode angibt. So kann unser Immunostaining Analyse Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen auf die Muskelmasse Zusammensetzung in vielen Modellen des Alterns und Myopathie angewendet werden.
Introduction
Es hat seit einiger Zeit bekannt, die Skelettmuskulatur aus Einzelfasern von vielen Arten1besteht. Zunächst wurden zwei Gruppen von Fasern anhand ihrer kontraktilen Eigenschaften charakterisiert und benannt, entsprechend langsam zuckenden (Typ I) und Fast-Twitch (Typ II). Diese Kategorien wurden auf der Grundlage der Faser Stoffwechsel weiter unterschieden. Da Typ-I-Fasern sind reich an Mitochondrien und angewiesen auf oxidativen Stoffwechsel, wurden sie aufgeklärt durch robust positiven Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide-Tetrazolium-Reduktase (NADH-TR) Diaphorase2 oder Succinat Dehydrogenase (SDH)3 Färbung. Im Gegensatz dazu, Typ-II-Fasern weniger ausgestellt und Variablen Grad von NADH-TR Diaphorase oder SDH Färbung und wurden in zwei Fast-Twitch-Untergruppen unterteilt (Typ IIA und IIB Typ) etwas grob anhand ihrer relativen oxidativen Kapazitäten. Diese Unterscheidungen zwischen Fasern haben effektiver durch Myosin-ATPase Färbung visualisiert worden wo Typ I Fasern färben dunkel nach einer Vorinkubation bei pH 4.0 und Typ IIB Fasern absorbieren überstürzten folgende Vorinkubation bei pH 10,0 mit Typ IIA Fasern Färbung immer4.
Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp5entwickelt. Typ I, Typ IIA und Typ IIB Fasern können alle identifiziert werden mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil. Darüber hinaus eine weitere Fast-Twitch-metabolisch-Intermediate Fasertyp, Typ IIX, identifizierten6wurde. Hybrid-Fasern mit dem Ausdruck mehrere MyHC wurden auch bestätigten5,7,8. Einige Arten wie die Katze und der Pavian sind keine ausdrückliche Typ IIB MyHCs6bekannt. Obwohl MyHC Immunostaining derzeit die State-of-the-Art-Beurteilung der Muskel Zusammensetzung ist, ist die Analyse der Daten über diese Technik umständlich und zeitaufwändig ohne automatisierte Unterstützung. Zu diesem Zweck wurden eine Handvoll semi-automatischen Methoden, um diese Daten zu analysieren entwickelten5,9,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein relativ Standardprotokoll für immunhistochemische Identifizierung der Muskelfaser-Typ5,7,8,10, zusammen mit einer teilautomatisierten Roman Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie mit Genauigkeit beschleunigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir nützliche Richtung für die Identifizierung des skelettartigen Muskels Fasertypen bereitgestellt. Dabei beschreiben wir einen neuartigen Algorithmus zur Analyse der Daten.
Da unsere Ergebnisse frühere Berichte5,8,10 bestätigen weitgehend und spiegeln unsere eigenen manuellen Messungen, erscheint der Algorithmus um genau zu sein. Allerdings stießen wir auf einige seltene experimentel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar die Boettcher-Stiftung und die Amyotrophe Lateralsklerose Association (#17-II-344) für ihre Unterstützung dieser Forschung.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
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