Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling
Summary
Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.
Abstract
Jarenlang waren best onderscheid tussen skelet spiervezel typen gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring. Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator van fiber-type. Type I, type IIA, typ IIX en type IIB vezels kunnen nu worden geïdentificeerd met precisie op basis van het profiel van hun MyHC; Handmatige analyse van deze gegevens kan echter traag en omlaag-rechts vervelend. Snelle, nauwkeurige beoordeling van het type vezel samenstelling en morfologie is in dit verband een zeer wenselijk hulpmiddel. Hier presenteren we een protocol voor state-of-the-art immunohistochemische kleuring van MyHCs in bevroren secties muis stuk spier in concert met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels verkregen. Zoals verwacht, de Musculus soleus weergegeven kleuring voor type I en type IIA vezels, maar niet voor type IIX of type IIB vezels. Aan de andere kant, de tibialis anterior spier bestond voornamelijk uit type IIX en type IIB vezels, een klein deel van het type IIA vezels en weinig of geen typ ik vezels. Meerdere afbeelding transformaties werden gebruikt voor het genereren van waarschijnlijkheid kaarten met het oog op het meten van de verschillende aspecten van de morfologie van de vezel (d.w.z., doorsnede (CSA), maximale en minimale Feret diameter). De waarden voor deze parameters vervolgens met handmatig verkregen waarden vergeleken werden. Geen significante verschillen werden waargenomen tussen beide modus van analyse met betrekking tot CSA, maximale of minimale Feret diameter (alle p > 0,05), met vermelding van de nauwkeurigheid van onze methode. Dus kan onze immunokleuring analyse protocol worden toegepast op het onderzoek van de effecten op de spier samenstelling in vele modellen van veroudering en myopathie.
Introduction
Het is gekend voor enige tijd dat skeletspier uit één vezels van vele typen1 bestaat. Aanvankelijk twee soorten vezels werden gekenmerkt op basis van hun contractiele eigenschappen en genoemd, naar behoren, slow-twitch (type I) en fast-twitch (type II). Deze categorieën werden verder onderscheiden op basis van glasvezel metabolisme. Daar typ ik vezels zijn rijk aan mitochondriën en afhankelijk van het oxidatieve metabolisme, ze werden toegelicht door krachtig positieve nicotinamide adenine dinucleotide-tetrazolium reductase (NADH-TR) diaphorase2 of succinaat dehydrogenase (SDH)3 kleuring. Daarentegen, type II vezels minder tentoongesteld en variabele graden van NADH-TR diaphorase of SDH kleuring en werden verdeeld in twee subgroepen van de fast-twitch (typt u IIA en IIB) enigszins ruw op basis van hun relatieve oxidatieve capaciteit. Dit onderscheid tussen vezels hebben effectiever zijn gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring wanneer type-I vezels donkere vlekken na een pre-incubatie bij pH 4.0 en type IIB vezels absorberen overhaaste volgende pre-incubatie bij pH 10.0 met type IIA vezels kleuring gearchiveerd4.
Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator type vezel5. Type I, type II en type IIB vezels kunnen worden alle geïdentificeerd met precisie op basis van hun MyHC profiel. Bovendien, een ander type van de fast-twitch metabolisch intermediair vezel, IIX, typ geweest geïdentificeerde6. Hybride vezels uiting van meer dan één MyHC zijn ook bevestigde5,7,8. Sommige soorten zoals de kat en de baviaan bekend er niet uitdrukkelijke Type IIB MyHCs6. MyHC immunokleuring is momenteel de state-of-the-art beoordeling van spier samenstelling, wel de analyse van de gegevens die zijn verkregen via deze techniek omslachtig en tijdrovend zonder geautomatiseerde hulp. Te dien einde geweest een handvol semi-geautomatiseerde methoden voor het analyseren van deze gegevens ontwikkelde5,9,10. Hier presenteren we een relatief standaardprotocol voor de immunohistochemische identificatie van spiervezel-type5,7,8,10, samen met een semi-automatische roman algoritme dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels met nauwkeurigheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij hebben hier nuttig richting voor de identificatie van skeletale spiervezel typen verstrekt. Daarbij beschrijven we een nieuw algoritme voor analyse van de gegevens.
Omdat onze resultaten grotendeels die van eerdere verslagen5,–8,10 te bevestigen en onze eigen handmatige metingen weerspiegelen, weergegeven het algoritme nauwkeurig te zijn. Nog steeds, ondervonden we sommige zeldzame experimentele v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan de Boettcher-Stichting en de vereniging Amyotrofische laterale sclerose (#17-II-344) voor hun steun aan dit onderzoek.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
