Summary

Шарик на основе мультиплекс пробирного анализа слезоточивый цитокинового профиля

Published: October 13, 2017
doi:

Summary

Анализ слезоточивый фильм цитокинов помогает в изучении различных глазных заболеваний. Мультиплекс шарик на основе простых и чувствительной и включить тестирование нескольких целей в образцах с небольшими объемами. Здесь мы описываем протокол для слезоточивый фильм цитокина профилирования с использованием бисера на основе мультиплекс пробирного.

Abstract

Слезной пленки представляет собой сложную смесь липидов, белков и минералов, которая охватывает внешней поверхности глаза, тем самым обеспечивая смазки, питания и защиты в базовой ячейки. Анализ слез является новой областью для идентификации биомаркеров для прогнозирования, диагностики и прогноз различных глазных заболеваний. Слезы легко доступны и их коллекции является неинвазивным. Таким образом продвижение технологии приобретают известность для идентификации нескольких аналитов в слезах для изучения изменений в составе белка или метаболита и его связь с патологических состояний. Слезоточивый цитокины являются идеальным биомаркеров для изучения здоровья глазной поверхности, а также помочь в понимании механизмов различных глазной поверхности расстройств, таких как сухой глаз болезни и весеннем конъюнктивите. Шарик на основе мультиплекс анализов имеют возможность обнаружения нескольких аналитов в небольшое количество образцов с высокой чувствительностью. Здесь мы описываем стандартизированный протокол взятия образца, извлечения и анализа цитокина профилирования с использованием бисера мультиплекс пробирного.

Introduction

Слезы производятся слезных желез и аксессуаров желез и пальто внешней поверхности глаза. Слезной пленки состоит из наружной липидного слоя и внутренний водный слой, который включает в себя растворимые белки, муцин и мембраной связаны муцин. Слезы предотвращения вторжения микробов, поставки питательных веществ и обеспечивают смазку поверхности глаза. Слезы действовать как интерфейс между воздухом и ткани для транспорта кислорода к роговице. 1 слезной пленки состоит из белков, углеводов, липидов и электролитов. Ассоциация между слезоточивый белки с глазной и соматических заболеваний, как глаукома, заболевания сухой глаз, весеннем конъюнктивите, сахарный диабет, офтальмопатии связанных с щитовидной железы и рака была обнаружена в нескольких исследованиях. 2 , 3 , 4 слезоточивый образцы могут быть собраны, микрокапиллярной трубы или разрыв потока полосы (Ширмер полоски). Кроме того Ширмер испытаний является стандартной процедурой в роговице и рефракционной хирургии клиники, результаты которого могут использоваться для анализа анализов цитокина. Неинвазивная проб, доступность био-образца и Ассоциация слезоточивый композиции с различных физиологических и патологических условиях сделать слезной пленки потенциальным источником биомаркеров для нескольких глазных и соматических заболеваний. 4 , 5 , 6

Слеза цитокинов играет важную роль в изучении глазной поверхности здоровья и воспалительных процессов различных глазных заболеваний. 7 аномальные концентрации ряда цитокинов в образцах слезоточивый сообщалось ассоциироваться с сухой глаз болезни, весенний кератоконъюнктивит (VKC), атопический кератоконъюнктивит (АКС), сезонный аллергический конъюнктивит и увеита. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 слезоточивый белки могут быть проанализированы традиционными методами как масс-спектрометрии, Западный blotting и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). 14 , 15 однако ограничения этих методов являются бедные чувствительность и больший объем выборки, необходимых для анализа нескольких слезоточивый цитокинов у каждого пациента. 16 , 17 мультиплекс анализов шарик на основе разработаны для анализа нескольких аналитов в сложной смеси образцов и успешно применяется на слезоточивый образцы для анализа нескольких цитокинов в различных заболеваний. 6 , 18 A сочетание сэндвич ELISA и потока цитометрии методы позволяют эти анализы стать более чувствительными, чем ELISA для количественного определения нескольких аналитов в одном образце. 19 этот метод может применяться на различных клинических образцов и supernatants культуры клеток и помогает в изучении иммунных реакций в некоторых патофизиологических условий. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Есть несколько исследований, сравнение шарик на основе мультиплекс assays ELISA и сообщили о корреляции между методами. Лоо et al. по сравнению шарик на основе мультиплекс пробирного с обычными ELISA для обнаружения адипонектина, resistin, лептина и Грелин в образцах сыворотки или плазмы и сообщил сильная корреляция (r > 0,9) между анализов. 25 Dupont et al. сообщили сильная корреляция между мультиплекс шарик на основе анализов и ELISA для обнаружения ИЛ 1β, Ил-4, Ил-5, IL-6, Ил-10, ИФН ϒ и ФНО α в фитогемагглютинина и липополисахарида стимулировали цельной крови собранные из беременных женщин. 26 Пикеринг et al. сообщили еще сильная корреляция между шарик на основе мультиплекс пробирного и ELISA для обнаружения сыворотке антител к гемофилического гриппа типа b полисахарид (r = 0,96), анатоксинов Столбнячная палочка (r = 0,96) и Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Бьяджини et al. сообщили высокая положительная корреляция (r = 0.852) между шарик на основе мультиплекс пробирного и ELISA для обнаружения Bacillus anthracis анти PA IgG в образцах сыворотки. 28 Wang et al. сообщили корреляцию между шарик на основе мультиплекс пробирного и ELISA для обнаружения болезни Альцгеймера биомаркеров амилоид β 42 (r = 0,77), Общая Тау (r = 0,94) и Тау фосфорилированных на аминокислоты 181 (r = 0,82) в образцов спинномозговой жидкости. 29 эти исследования продемонстрировали, что применимость шарик мультиплекс анализов на основе различных клинических образцов, меньшего объема требований образца и корреляция с стандартным ELISA, которые делают мультиплекс анализов шарик на основе перспективных альтернативой для традиционных методов ELISA для обнаружения нескольких аналитов в различных типов образцов в различных заболеваний фенотипов. Здесь мы описываем стандартизированный протокол для бисера на основе мультиплекс assay для цитокина профилирования для 41 аналитов в пробах слезоточивый из здоровых испытуемых с помощью Ширмер полоски.

Protocol

протоколы, используемые в данном исследовании были утверждены институционального обзора Советом больницы Тан Ток Сенг, Сингапур. 1. рвать Cytokine анализ коллекции слез: спросить предмет комфортно сидеть на стуле экспертизы и место его головой подголовн?…

Representative Results

Слеза образцы были собраны от 8 глаз 4 здоровых испытуемых, используя слезоточивый поток полос и уровни цитокина были проанализированы с использованием упомянутых выше протокола. Все предметы были мужского пола и возраста четырех предметов было 36, 42, 44 и 52 лет соответс?…

Discussion

Цитокины являются маленькие сотовой секретируемые белки и мощным иммунных модуляторов, регулировании иммунной реакции. 32 выражение профили различных цитокинов в слезу образцы связаны с различных патологических состояний глаз и исследования cytokine, профили помогают понят?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Научно-исследовательская работа была поддержана центр грант от Тан Tock Сенг больница персонализированные семян финансирования программы к 2015 году; Сингапур глаз исследовательский институт пилот Грант и Тан Ток Сенг больницы шаг за фонда субсидии.

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair

References

  1. Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
  2. von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
  3. Pieragostino, D., D’Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
  4. Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
  5. Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
  6. Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
  7. Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
  8. Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
  9. Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
  10. Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
  11. Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
  12. Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
  13. Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
  14. Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
  15. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
  16. Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
  17. Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
  18. Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
  19. Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
  20. Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
  21. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  22. Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  23. Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
  24. Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
  25. Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
  26. Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
  27. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
  28. Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
  29. Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
  30. Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
  31. . The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
  32. Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
  33. Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
  34. Tighe, O., Negm, I., Todd, L., Fairclough, Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
  35. Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
  36. Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
  37. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
  38. VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  39. Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
  40. Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O’Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
  41. Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
  42. Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
  43. Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).

Play Video

Cite This Article
Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).

View Video