Summary

Grânulo baseado Multiplex ensaio para análise de perfis de citocinas lágrima

Published: October 13, 2017
doi:

Summary

Análise do filme lacrimal citocinas ajuda no estudo de várias doenças oculares. Grânulo baseado multiplex ensaios são simples e sensível e permitem o teste de alvos múltiplos em amostras com volumes pequenos. Aqui descrevemos um protocolo para lágrima filme cytokine perfis usando o um grânulo baseado multiplex do ensaio.

Abstract

Filme lacrimal é uma mistura complexa de lipídeos, proteínas e minerais que cobre a superfície externa do olho, proporcionando assim a lubrificação, nutrição e proteção para as células subjacentes. Análise de lágrimas é uma área emergente para a identificação de biomarcadores para a predição, diagnóstico e prognóstico de diversas doenças oculares. As lágrimas são facilmente acessíveis e sua coleção é não-invasivo. Portanto, avanço de tecnologias estão ganhando destaque para identificação dos vários analitos em lágrimas para estudar alterações na composição da proteína ou metabólito e sua associação com condições patológicas. Lágrima de citocinas são biomarcadores ideais para estudar a saúde da superfície ocular e também ajudam na compreensão dos mecanismos de diferentes transtornos de superfície ocular como doença de olho seco e conjuntivite vernal. Ensaios de multiplex do grânulo com base têm a capacidade de detectar analitos múltiplos em uma pequena quantidade da amostra com uma maior sensibilidade. Aqui descrevemos um protocolo padronizado de coleta de amostra de lágrima, extração e análise de citocinas perfil usando uma conta com base em ensaio multiplex.

Introduction

As lágrimas são produzidas pela glândula lacrimal e glândulas acessórias e revestir a superfície externa do olho. Filme lacrimal é composto por uma camada lipídica externa e uma camada interna aquosa que inclui proteínas solúveis, mucins e membrana limite mucins. Lágrimas impedem invasão microbiana, fornecem nutrientes e fornecem a lubrificação da superfície ocular. Lágrimas agir como interface entre o ar e o tecido para o transporte de oxigênio para a córnea. 1 filme lacrimal é composto por proteínas, carboidratos, lipídios e eletrólitos. A associação entre proteínas da lágrima com doenças sistêmicas e oculares como glaucoma, doença de olho seco, conjuntivite vernal, diabetes mellitus, câncer e Orbitopatia associada a tiroide foi identificada em vários estudos. 2 , 3 , 4 amostras de lágrima podem ser recolhidas por conta de tubos ou lágrima fluxo tiras (tiras de Schirmer). Além disso, o teste de Schirmer é um procedimento padrão realizado na córnea e clínicas de cirurgia refrativa, cujos resultados podem ser usados para ensaios de análise de citocinas. Coleta de amostra não-invasivos, acessibilidade do bio-espécime e a associação de lágrima composição com várias condições fisiológicas e patológicas certifique-se de rasgar a película uma fonte potencial de biomarcadores para diversas doenças oculares e sistêmicas. 4 , 5 , 6

Lágrima de citocinas desempenha um papel importante no estudo da saúde de superfície ocular e condições inflamatórias de várias doenças oculares. 7 concentrações anormais de várias citocinas em lágrima amostras foram relatadas para ser associado com a doença de olho seco, ceratoconjuntivite vernal (VKC), ceratoconjuntivite atópica (AKC), conjuntivite alérgica sazonal e uveíte. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 proteínas de lágrima podem ser analisadas por métodos tradicionais, como a espectrometria de massa, mancha ocidental e ensaios imunoenzimático (ELISA). 14 , 15 no entanto, as limitações destes métodos são pobre sensibilidade e um maior volume de amostra necessário para a análise de várias citocinas de lágrima em cada paciente. 16 , 17 ensaios multiplex do grânulo baseado foram desenvolvidos para analisar vários analitos em amostras de mistura complexa e aplicados com sucesso em amostras de lágrima para analisar várias citocinas em doenças diferentes. 6 , 18 A combinação de sanduíche ELISA e técnicas de citometria de fluxo permitem que estes ensaios tornar-se mais sensível que o ELISA para a quantificação de analitos múltiplos em uma única amostra. 19 . este método pode ser aplicado em uma variedade de amostras clínicas e sobrenadantes de cultura de células e ajuda no estudo das respostas imunes em várias condições fisiopatológicas. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Existem vários estudos comparando multiplex do grânulo com base em ensaios com ELISA e relataram uma correlação entre os métodos. Grânulo de Loo et al . em comparação com base ensaio multiplex com ELISA convencional para a detecção de adiponectina, resistina, leptina e grelina em amostras de soro ou plasma humanas e relatou uma forte correlação (r > 0.9) entre os ensaios. 25 . Dupont et al relataram uma forte correlação entre ensaios multiplex do grânulo baseado e ELISA para a detecção de IL-1 β, IL-4, IL-5, IL-6, em Fitohemaglutinina e lipopolissacarídeo de TNF-α, IL-10 e IFN-ϒ estimularam sangue total coletados de mulheres grávidas. 26 . Pickering et al relataram outro forte correlação entre ensaio multiplex do grânulo baseado e ELISA para a detecção de anticorpos de soro de polissacarídeo de Haemophilus influenzae tipo b (r = 0,96), toxoides de Clostridium tetani (r = 0,96) e Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 . Biagini et al relataram uma alta correlação positiva (r = 0.852) entre ensaio multiplex do grânulo baseado e ELISA para a deteção do Bacillus anthracis anti-PA IgG em amostras de soro. 28 . Wang et al relataram uma correlação entre ensaio multiplex do grânulo baseado e ELISA para a detecção de doença de Alzheimer biomarcadores amiloide-β 42 (r = 0,77), tau total (r = 0,94) e tau fosforilada em aminoácido 181 (r = 0,82) em amostras de líquido cefalorraquidiano. 29 estes estudos demonstraram que a aplicabilidade do grânulo baseado multiplex ensaios numa variedade de amostras clínicas, menores requisitos do volume da amostra e uma correlação com ELISA padrão, que fazem ensaios multiplex do grânulo com base em um promissor alternativa aos métodos tradicionais de ELISA para a detecção de vários analitos em diferentes tipos de amostras em fenótipos diferentes doenças. Aqui descrevemos um protocolo padronizado para ensaio multiplex de grânulo com base para perfil de citocinas para 41 analitos em lágrima amostras coletadas de indivíduos saudáveis, usando tiras de Schirmer.

Protocol

os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional do Tan Tock Seng Hospital, Singapore. 1. análise de Cytokine rasgar coleção de lágrimas: pedir o assunto para sentar-se confortavelmente em uma cadeira de exame e coloque sua cabeça contra o encosto de cabeça. Pedir o assunto para olhar para cima, com cuidado abra as tiras de Schirmer (feitas de papel de filtro Whatman n. 41) e coloque a extremidad…

Representative Results

Rasgo as amostras foram coletadas de 8 olhos de 4 indivíduos saudáveis usando tiras de fluxo de lágrima e níveis de citocinas foram analisados usando o protocolo acima mencionado. Todos os indivíduos eram do sexo masculinos e a idade dos quatro temas foi 36, 42, 44 e 52 anos respectivamente. Saúde de superfície ocular e olho seco doença foi avaliada por meio de ensaios clínicos (lágrima filme acabar tempo, Schirmer teste, coloração da córnea, a coloração da conjuntiva, exam…

Discussion

Citocinas são pequenas proteínas secretadas celulares e potentes imunes moduladores regulando respostas imunes. 32 os perfis de expressão de diversas citocinas em lágrima amostras estão relacionadas a diversas condições patológicas do olho e estudos sobre cytokine perfis ajudam a compreender os mecanismos da patogênese da doença, determinar o estado de saúde ocular, severidade da doença, diagnóstico e progressão. 2 , 5 concen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho de pesquisa foi apoiado pela subvenção centro de Tan Tock Seng Hospital personalizado semente financiamento programa 2015; Singapore Eye Research Institute piloto Grant e Tan Tock Seng Hospital passo fundo para concedem.

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair

References

  1. Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
  2. von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
  3. Pieragostino, D., D’Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
  4. Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
  5. Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
  6. Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
  7. Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
  8. Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
  9. Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
  10. Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
  11. Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
  12. Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
  13. Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
  14. Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
  15. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
  16. Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
  17. Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
  18. Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
  19. Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
  20. Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
  21. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  22. Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  23. Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
  24. Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
  25. Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
  26. Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
  27. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
  28. Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
  29. Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
  30. Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
  31. . The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
  32. Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
  33. Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
  34. Tighe, O., Negm, I., Todd, L., Fairclough, Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
  35. Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
  36. Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
  37. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
  38. VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  39. Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
  40. Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O’Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
  41. Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
  42. Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
  43. Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).

Play Video

Cite This Article
Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).

View Video