Um modelo de cultura celular de artérias de resistência
Summary
É descrito um modelo de cultura celular de artérias de resistência, permitindo a dissecção da sinalização de caminhos no endotélio, músculo liso, ou entre o endotélio e músculo liso (a junção de myoendothelial). A aplicação selectiva de agonistas ou isolamento da proteína, microscopia eletrônica ou imunofluorescência pode ser utilizada usando esse modelo de cultura celular.
Abstract
A junção myoendothelial (MEJ), um único microdomain sinalização nas artérias de resistência de pequeno diâmetro, exibe a localização de proteínas específicas e processos de sinalização que podem controlar o tônus vascular e pressão sanguínea. Como é uma projeção de qualquer célula endotelial ou músculo liso e devido ao seu pequeno tamanho (em média, uma área de ~ 1 µm2), o MEJ é difícil estudar isoladamente. No entanto, nós desenvolvemos um modelo de cultura de células chamado de cultura de células vasculares, co (VCCC) que permite em vitro MEJ formação, polarização da célula endotelial e dissecação de processos na parede vascular da resistência e proteínas de sinalização artérias. A VCCC tem uma infinidade de aplicações e pode ser adaptado para se adequar a diferentes tipos de células. O modelo consiste de dois tipos de células cultivados em lados opostos de um filtro com 0,4 µm poros, em que o em vitro Dinho Mello pode formar. Aqui descrevemos como criar o VCCC via chapeamento de células e isolamento de endotelial, MEJ e frações de músculo liso, que podem ser usadas para o isolamento de proteínas ou atividade ensaios. O filtro com camadas de célula intacta pode ser fixo, incorporado e seccionado para análise de imunofluorescência. Importante, muitas das descobertas deste modelo foram confirmadas usando artérias de resistência intacta, ressaltando sua relevância fisiológica.
Introduction
Nas artérias de resistência de pequeno diâmetro, uma fina lâmina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) e células musculares lisas (SMC). As células podem projeto através de furos nesta matriz elástica e fazer conexões citoplasmáticas diretas via lacuna junção canais1,2. Esta estrutura original é denominada junção myoendothelial (MEJ). O MEJ é um pequeno (aproximadamente 0,5 µm x 0,5 µm, dependendo da cama vascular), projeção celular composta predominantemente por células endoteliais, mas pode se originar de músculo liso também3,4. Um número de investigadores demonstraram a imensa complexidade de sinalização de redes que ocorrer seletivamente no MEJ, tornando-o um local especialmente importante para facilitar a sinalização de bi-direcional entre endotélio e músculo liso5 ,6,7,8,9,10.
No entanto, uma dissecação mecanicista das vias de sinalização para o MEJ é difícil em uma artéria intacta. Porque o MEJ é uma projeção de celular, não é atualmente possível isolar um na vivo MEJ da parede vascular. Por este motivo, foi desenvolvido o modelo VCCC1 . Importante, a VCCC Replica fisiológicas morfologia endotelial11 e polarização de sinalização entre o apical e MEJ porções da célula12. Foi este modelo que facilitou a descoberta de que a alfa-hemoglobina na célula endotelial, é polarizada para o MEJ. Isto está em contraste com células endoteliais convencionalmente cultivadas que não expressam alfa hemoglobina13. Para pesquisadores interessados no endotélio microvascular, pode ser mais adequado utilizar células endoteliais, que tenham sido cultivadas na VCCC, particularmente se a intenção é dissecar as vias de sinalização que ocorrem nas artérias de resistência de pequeno diâmetro.
Usando uma inserção plástica resistente, contendo um filtro com poros de pequeno diâmetro (0,4 µm de diâmetro) para tipos de células distintas de co-cultura dois impede que as células migrando entre camadas. Isso resulta em uma distância de 10 µm entre as células, que é significativamente maior do que em vivo, mas ainda Replica muitas das características de Dinho Mello, incluindo a localização da proteína e segundo mensageiro sinalização1 na vivo , 14. Além disso, o VCCC permite a segmentação da célula tipo específico de sinalização através da adição de um agonista ou antagonista ao compartimento celular específico. Por exemplo, carregar o CE com BAPTA-AM de Quelato de cálcio e estimulando o SMC com fenilefrina14. Em contraste com outras descrições de co-cultura modelos15,16,17,18,19,20,21, isto fornece instruções sobre como isolar as distintas frações de mRNA e proteína, incluindo a fração MEJ distinta dentro dos poros do filtro. A adição desta técnica para a VCCC permite investigações específicas de mudanças na localização do mRNA ou transcrição22, fosforilação de proteínas12,23e proteína atividade12. Este artigo irá descrever chapeamento da CE no topo do filtro e SMC na parte inferior, embora seja possível à cultura os tipos de duas células em diferentes conformações11,18,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
A VCCC tem uma série de vantagens em termos de recapitulando Dinho Mello em vitro, mas existem pontos de discussão ao determinar se o VCCC pode ser utilizado para aplicações específicas. Por exemplo, se diferentes tipos de células a ser usado com este modelo, ele precisará ser otimizado. Nós usamos as células humanas primárias, mas é possível isolar as células da aorta bovina24, ou sua ou mata-mata ratos, e usá-los na VCCC1,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela nacional do coração, pulmão e sangue Instituto concede R01088554, T32HL007284 e American Heart Association 14PRE20420024 de bolsa de doutoramento. Agradecemos especialmente a St Jude celular Imaging compartilhado pesquisa núcleo, incluindo Randall Wakefield e Linda Horner para as imagens de microscopia eletrônica, Adam Straub para obter assistência com imagens representativas da imunofluorescência e Pooneh Bagher por ela Comentários valiosos sobre o protocolo de manuscrito.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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